рРНК-белковые взаимодействия в 70S рибосомах Escherichia coli и в комплексе инициации по данным сшивок бифункциональным производным платины (II)
Исследованы рРНК-белковые сшивки в 70S рибосомах, меченных ³⁵S, в свободном состоянии и с составе комплекса инициации рибосома-AUGU6-fMet-тРНКMet с использованием, бифункционального реагента {дихлор[N,N,N',N'-тетракис-(2-аминоэтил)-1,6-гексаметилендиаминдиплатина)}дихлорида. Наборы белков,...
Збережено в:
| Дата: | 1989 |
|---|---|
| Автори: | , , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154978 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | рРНК-белковые взаимодействия в 70S рибосомах Escherichia coli и в комплексе инициации по данным сшивок бифункциональным производным платины (II) / П.Г. Чистяков, М.А. Абдукаюмов, А.Г. Веньяминова, С.Н. Владимиров, Д.М. Грайфер, С.А. Казаков, Г.Г. Карпова // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 54-60. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154978 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1549782025-02-23T18:01:29Z рРНК-белковые взаимодействия в 70S рибосомах Escherichia coli и в комплексе инициации по данным сшивок бифункциональным производным платины (II) рРНК-білкові взаємодії в 70S рибосомах Escherichia coli і в комплексі ініціації за даними зшивок біфункціональними похідними платини (II) rRNA-protein interactions in Escherichia coli 70S ribosomes and in complex of initiation by data of cross-links with bifunctional Pt(II) derivative Чистяков, П.Г. Абдукаюмов, М.А. Веньяминова, А.Г. Владимиров, С.Н. Грайфер, Д.М. Казаков, С.А. Карпова, Г.Г. Структура и функции биополимеров Исследованы рРНК-белковые сшивки в 70S рибосомах, меченных ³⁵S, в свободном состоянии и с составе комплекса инициации рибосома-AUGU6-fMet-тРНКMet с использованием, бифункционального реагента {дихлор[N,N,N',N'-тетракис-(2-аминоэтил)-1,6-гексаметилендиаминдиплатина)}дихлорида. Наборы белков, сшивающихся с 16S и 23S рРНК в свободых 70S рибосомах и в комплексе рибосом с матрицей и инициаторной тРНК, различаются незначительно. Досліджено рРНК-білкові зшивки в 70S рибосомах, мічених ³⁵S, у вільному стані і у складі комплексу ініціації рибосома-AUGU6-fMet-тРНКMet з використанням біфункціонального реагенту {дихлор[N,N,N',N'-тетракіс-(2-аміноетил)-1,6-гексаметилендіаміндиплатину)}дихлориду. Набори білків, що зшиваються з 16S і 23S рРНК у вільних 70S рибосомах та в комплексі рибосом з матрицею і ініціаторною тРНК, різняться незначно. rRNA-protein cross-links in 70S ³⁵S-labelled ribosomes in the free state and within initiation complex ribosome-AUGU6-fMet-tRNAfMet were investigated using bifunctional cleavable reagent {dichloro [N,N,N',N'-tetrakis- (2-aminoethyl) -1.6-hexamethylendiamine-diplatinum(II)]}dichloride. The sets of proteins cross-linked to 16S and 23S rRNA in free 70S ribosomes and in 70S initiation complex were shown to slightly differ. It was found that one of L7/L12 dimers borders on one of 16S rRNA sites (a distance <5 nm) both in free ribosomes and in initiation complex. 1989 Article рРНК-белковые взаимодействия в 70S рибосомах Escherichia coli и в комплексе инициации по данным сшивок бифункциональным производным платины (II) / П.Г. Чистяков, М.А. Абдукаюмов, А.Г. Веньяминова, С.Н. Владимиров, Д.М. Грайфер, С.А. Казаков, Г.Г. Карпова // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 54-60. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.0000C1 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154978 577.217.34 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров |
| spellingShingle |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Чистяков, П.Г. Абдукаюмов, М.А. Веньяминова, А.Г. Владимиров, С.Н. Грайфер, Д.М. Казаков, С.А. Карпова, Г.Г. рРНК-белковые взаимодействия в 70S рибосомах Escherichia coli и в комплексе инициации по данным сшивок бифункциональным производным платины (II) Биополимеры и клетка |
| description |
Исследованы рРНК-белковые сшивки в 70S рибосомах, меченных ³⁵S, в свободном состоянии и с составе комплекса инициации рибосома-AUGU6-fMet-тРНКMet с использованием, бифункционального реагента {дихлор[N,N,N',N'-тетракис-(2-аминоэтил)-1,6-гексаметилендиаминдиплатина)}дихлорида. Наборы белков, сшивающихся с 16S и 23S рРНК в свободых 70S рибосомах и в комплексе рибосом с матрицей и инициаторной тРНК, различаются незначительно. |
| format |
Article |
| author |
Чистяков, П.Г. Абдукаюмов, М.А. Веньяминова, А.Г. Владимиров, С.Н. Грайфер, Д.М. Казаков, С.А. Карпова, Г.Г. |
| author_facet |
Чистяков, П.Г. Абдукаюмов, М.А. Веньяминова, А.Г. Владимиров, С.Н. Грайфер, Д.М. Казаков, С.А. Карпова, Г.Г. |
| author_sort |
Чистяков, П.Г. |
| title |
рРНК-белковые взаимодействия в 70S рибосомах Escherichia coli и в комплексе инициации по данным сшивок бифункциональным производным платины (II) |
| title_short |
рРНК-белковые взаимодействия в 70S рибосомах Escherichia coli и в комплексе инициации по данным сшивок бифункциональным производным платины (II) |
| title_full |
рРНК-белковые взаимодействия в 70S рибосомах Escherichia coli и в комплексе инициации по данным сшивок бифункциональным производным платины (II) |
| title_fullStr |
рРНК-белковые взаимодействия в 70S рибосомах Escherichia coli и в комплексе инициации по данным сшивок бифункциональным производным платины (II) |
| title_full_unstemmed |
рРНК-белковые взаимодействия в 70S рибосомах Escherichia coli и в комплексе инициации по данным сшивок бифункциональным производным платины (II) |
| title_sort |
ррнк-белковые взаимодействия в 70s рибосомах escherichia coli и в комплексе инициации по данным сшивок бифункциональным производным платины (ii) |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1989 |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154978 |
| citation_txt |
рРНК-белковые взаимодействия в 70S рибосомах Escherichia coli и в комплексе инициации по данным сшивок бифункциональным производным платины (II) / П.Г. Чистяков, М.А. Абдукаюмов, А.Г. Веньяминова, С.Н. Владимиров, Д.М. Грайфер, С.А. Казаков, Г.Г. Карпова // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 3. — С. 54-60. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT čistâkovpg rrnkbelkovyevzaimodejstviâv70sribosomahescherichiacoliivkomplekseiniciaciipodannymsšivokbifunkcionalʹnymproizvodnymplatinyii AT abdukaûmovma rrnkbelkovyevzaimodejstviâv70sribosomahescherichiacoliivkomplekseiniciaciipodannymsšivokbifunkcionalʹnymproizvodnymplatinyii AT venʹâminovaag rrnkbelkovyevzaimodejstviâv70sribosomahescherichiacoliivkomplekseiniciaciipodannymsšivokbifunkcionalʹnymproizvodnymplatinyii AT vladimirovsn rrnkbelkovyevzaimodejstviâv70sribosomahescherichiacoliivkomplekseiniciaciipodannymsšivokbifunkcionalʹnymproizvodnymplatinyii AT grajferdm rrnkbelkovyevzaimodejstviâv70sribosomahescherichiacoliivkomplekseiniciaciipodannymsšivokbifunkcionalʹnymproizvodnymplatinyii AT kazakovsa rrnkbelkovyevzaimodejstviâv70sribosomahescherichiacoliivkomplekseiniciaciipodannymsšivokbifunkcionalʹnymproizvodnymplatinyii AT karpovagg rrnkbelkovyevzaimodejstviâv70sribosomahescherichiacoliivkomplekseiniciaciipodannymsšivokbifunkcionalʹnymproizvodnymplatinyii AT čistâkovpg rrnkbílkovívzaêmodíív70sribosomahescherichiacoliívkompleksíínícíacíízadanimizšivokbífunkcíonalʹnimipohídnimiplatiniii AT abdukaûmovma rrnkbílkovívzaêmodíív70sribosomahescherichiacoliívkompleksíínícíacíízadanimizšivokbífunkcíonalʹnimipohídnimiplatiniii AT venʹâminovaag rrnkbílkovívzaêmodíív70sribosomahescherichiacoliívkompleksíínícíacíízadanimizšivokbífunkcíonalʹnimipohídnimiplatiniii AT vladimirovsn rrnkbílkovívzaêmodíív70sribosomahescherichiacoliívkompleksíínícíacíízadanimizšivokbífunkcíonalʹnimipohídnimiplatiniii AT grajferdm rrnkbílkovívzaêmodíív70sribosomahescherichiacoliívkompleksíínícíacíízadanimizšivokbífunkcíonalʹnimipohídnimiplatiniii AT kazakovsa rrnkbílkovívzaêmodíív70sribosomahescherichiacoliívkompleksíínícíacíízadanimizšivokbífunkcíonalʹnimipohídnimiplatiniii AT karpovagg rrnkbílkovívzaêmodíív70sribosomahescherichiacoliívkompleksíínícíacíízadanimizšivokbífunkcíonalʹnimipohídnimiplatiniii AT čistâkovpg rrnaproteininteractionsinescherichiacoli70sribosomesandincomplexofinitiationbydataofcrosslinkswithbifunctionalptiiderivative AT abdukaûmovma rrnaproteininteractionsinescherichiacoli70sribosomesandincomplexofinitiationbydataofcrosslinkswithbifunctionalptiiderivative AT venʹâminovaag rrnaproteininteractionsinescherichiacoli70sribosomesandincomplexofinitiationbydataofcrosslinkswithbifunctionalptiiderivative AT vladimirovsn rrnaproteininteractionsinescherichiacoli70sribosomesandincomplexofinitiationbydataofcrosslinkswithbifunctionalptiiderivative AT grajferdm rrnaproteininteractionsinescherichiacoli70sribosomesandincomplexofinitiationbydataofcrosslinkswithbifunctionalptiiderivative AT kazakovsa rrnaproteininteractionsinescherichiacoli70sribosomesandincomplexofinitiationbydataofcrosslinkswithbifunctionalptiiderivative AT karpovagg rrnaproteininteractionsinescherichiacoli70sribosomesandincomplexofinitiationbydataofcrosslinkswithbifunctionalptiiderivative |
| first_indexed |
2025-11-24T06:34:27Z |
| last_indexed |
2025-11-24T06:34:27Z |
| _version_ |
1849652483142451200 |
| fulltext |
У Д К 577.217.34
П. Г. Чистяков, М. А. Абдукаюмов, А. Г. Веньяминова, С. Н. Владимиров,
Д. М. Грайфер, С. А. Казаков, Г. Г. Карпова
рРНК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
В 70 S РИБОСОМАХ ESCHERICHIA COLI
И В К О М П Л Е К С Е ИНИЦИАЦИИ ПО ДАННЫМ СШИВОК
БИФУНКЦИОНАЛЬНЫМ ПРОИЗВОДНЫМ ПЛАТИНЫ (II)
Исследованы рРНК-белковые сшивки в 70S рибосомах, меченных 35S, в свободном
состоянии и с составе комплекса инициации рибосома-AUGU6-fMet-rP/Z/CfMot с исполь-
зованием, бифункционального реагента {дихлор[N,N,N',N'-тетракис-(2-аминоэтил)-1,6-
гексаметилендиаминдиплатина)}дихлорид. Наборы белков, сшивающихся с 16S и 23S
рРНК в сноб(х)ныχ 70S рибосомах и в комплексе рибосом с матрицей и инициаторной
тРИК, различаются незначительно.
Введение. Д л я изучения функциональной топографии рибосом все
большее применение находят бифункциональные химические реагенты,
способные образовывать сшивки между нуклеиновыми кислотами и
белками [1] . К числу наиболее перспективных сшивающих реагентов
п р и н а д л е ж а т соединения платины. Ранее было показано, что бифунк-
циональные платиновые реагенты образуют сшивки между биополиме-
рами, входящими в состав таких нуклеопротеидов, как хроматин [2] ,
вирусы [3] , 30S рибосомные субчастицы [4] , а т а к ж е комплексы
т Р Н К · а м и н о а ц и л - т Р Н К синтетаза [4, 5] , IF-3-30S субчастица [6] ,
EF-Ta-Phe-TPHKphe [7] . Недавно была продемонстрирована возмож-
ность использования платиновых реагентов для изучения взаимодейст-
вия т Р Н К и м Р Н К с рибосомой в соответствующих комплексах [8] .
Однако практически все работы по исследованию р Р Н К - б е л к о в ы х сши-
вок в рибосомах с помощью бифункциональных реагентов выполнены
на изолированных 70S рибосомах или рибосомных субчастицах. Дан-
ные по р Р Н К - б е л к о з ы м сшивкам в составе комплексов рибосом с
м Р Н К и т Р Н К полностью отсутствуют. С другой стороны, результаты
подобных исследований, выполненных с помощью метода прямых УФ-
индуцироваиных сшивок ['9, 101, свидетельствуют об изменении р Р Н К -
белковых контактов в зависимости от функционального состояния ри-
босом. Ii настоящей работе с использованием реагента {дихлор-
[Ν ,Ν ,Ν ' ,Ν ' - тетракис - (2 - аминоэтил) - 1 б - гексаметилендиаминди-
платина J} д и Χ л о Ρ ид (PtoAinCI1) изучены РРН К-белковые сшп икп изо-
лированных 70S рибосомах, меченных 35S и в составе комплекса ини-
циации [ - S ] 70S р и б о с о м а - A U G U 6 - f М е t - т Р Н К М е t f :
Материалы и методы. В работе использовали TPHKf M e t фирмы «Bochringcr Mann-
heim» (ФРГ). [3 5S]80S и [3 5S]50S рибосомные субчастицы получали, как описано
в [111- Препарат AUGU6 и [35S] fMet-τΡΗΚίM e t получали по методике, описанной
в [12]. Степень аминоацилирования составляла 1200 пмолей, а степень формплпрова-
ния — 900 пмолей/1 OE2Go- Pt2AmCl4 синтезировали по [13]. Активность рибосом в
поли (U) -зависимом синтезе (Phe)2 тестировали по [11]. Для получения комплекса,
условно обозначенного нами как «комплекс инициации», смесь, содержащую 180 пмо-
лей [3 5S]80S субчастиц и 3720 пмолей AUGU6, инкубировали 5 мин при 0°С в 160 мкл
буфера связывания (20 мМ трис-НК03 , рН 7,5, 100 мМ KNO3, 10 мМ Mn(NO3)2)-
56 ISSN 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. Kq 3 54
Затем добавляли ISO пмолсіі іМЄ!-ТРНКґ м м в 40 мкл буфера связывания и выдержи-
вали 10 мин при O0C. После этого в полученную смесь вносили 186 π молей p r , S]50S
субчастиц в 40 мкл буфера связывания. Комплекс инициации и свободные [ 3 5 S]70S
рибосомы выдерживали с 1 мМ Pi-AmCl4 при 20°С в течение 50 мин. Разделение 70S
рибосом, обработанных Pt2AmCl1 , па субчастицы проводили, как описано в [8], комп-
лекс инициации предварительно разрушали с помощью 0,1 M ЭДТА. рРНК-белковые
сшивки выделяли по [8] и pa ·.'у иг'.".п обработкой 2 M тиомочевиной при рН 3,5 (ин-
кубация при 37 cC в течение 1 ч). Липли;; рибосомных белков проводили двухмерным
электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) по модифицированной методике
[14], добавляя немеченые белки в качестве носителя. В первом направлении электро-
форез осуществляли в стеклянных капиллярах размером 0,5X70 мм. Пробу белков в
объеме 2—2,5 мкл наносили па слой концентрирующего геля длиной 2,5 мм. Электро-
форез вели при силе тока 0,5 мА па капилляр в течение 1,5 ч для разделения кислых
белков и силе тока 1 мА в течение 1 ч — для основных белков. Электрофорез во вто-
ром направлении вели в 22 %-пом ПААГ (рН геля 4,3) в пластинах размером 7 0 Х
Х 9 0 мм при толщине прокладок 0,5 мм и 20 °С в течение 1 ч. Стабилизация источника
напряжения по току 22 мА (охлаждение вентилятором). В отдельных экспериментах
кислые белки подвергали гель-электрофорезу, используя 18 %-пый ПААГ (рН геля 4,5)
[14] и увеличивая время электрофореза в первом и втором направлениях до 4,5 и 3 ч
соответственно, для разделения белков L7/L12 и S6.
Результаты и обсуждение . Комплекс инициации f M c t - T P H K M c t i ·
• A U G U 6 - J 3 S j 70S рибосома получали в буфере связывания , с о д е р ж а -
щем 10 мМ Mg2+. В п а р а л л е л ь н о м эксперименте, выполненном па не-
меченых рибосомах, методом фильтрации тройного комплекса через
нитроцеллюлозные фильтры было показано , что степень с в я з ы в а н и я
fMct -TPHK M e t f с рибосомами составляет 0,5 моля на моль рибосом.
В отсутствие матрицы с в я з ы в а н и я не наблюдалось . Д л я получения
р Р Н К - б е л к о в ы х сшивок [ 3 5 S] 70S рибосомы и комплекс инициации
[ 3 5 S] 70S рибосома -AUGUr, · fMet -TPHK M e t r о б р а б а т ы в а л и 1 мМ P t 2 A m C l 4
при 2 0 c C . В контрольном эксперименте па немеченых рибосомах б ы л о
показано , что диссоциации комплекса и п ш ш а ц и и после обработки 1 м М
реагентом практически не происходит. Более того ; д а ж е претьтикубация
рибосом с PioArnCl4 не приводит к их значительной инактиваттип .'по
крайней мере в системе поли (U) - зависимого синтеза д и ф е н и л а л а ш ш а ) .
Так, уровень с в я з ы в а н и я [ Н С ] P h e - T P H K P H E па рибосомах, контрольных
и о б р а б о т а н н ы х реагентом, составляет 1,77 и 1,36 моля т Р Н К на моль
рибосом; уровень синтеза д и ф е н и л а л а н и н а на обработанных PtoAmCl 4
рибосомах составлял не менее 60 % от такового в контрольном экспе-
рименте. О б р а б о т а н н ы е P t -AmCl 4 реакционные е м ' ^ и почв^пгалг цен-
трифугированию в градиенте плотности сахапозьт ( 1 5 — 3 0 % ) в усло-
виях диссоциации ρпб·.сом па субчастнцы (1 мМ Mg 2 +) . Ч а с т ь 70S ри-
босом (около 10 %) не диссоциировал а па субчастицы из-за образова -
ния межсубъединичпых сшивок как в свободных 70S рибосомах , т а к
и в составе комплекса инициации. Д л я определения степени ковалент-
ного присоединения F 3 3 S]рибосомных белков K р Р Н К [ 3 5 S] рибосомпые
субчастипы и I 3 5 S l 7 0 S рибосомы (не диссоциировавшие на субчасти-
цы) подпер га 'Ui центрифугированию в градиенте плотности с а х а р о з ы
(5—20 0 O в присутствии Л\Т1ТА и D S - N a (условия диссоциации рибо-
сом на р Р Н К и белки Г8]), ф р а к ц и и , соответствующие м а т е р и а л у с ко-
эффициентом седпмсп гацпи несколько большим, чем д л я 16S (23S)
р Р Н К , с о д е р ж а л и значительное количество радиоактивности. Очевид-
но, эта радиоактивность соответствовала сшивкам р Р Н К с [ 3 5 S ] б е л к а -
ми. В контрольном эксперименте центрифугированию в условиях дис-
социации на р Р Н К и белки подвергали F35S] рпбосомныс субчастнцы, тте
о б р а б о т а н н ы е платиновым реагентом. В этом случае фракции р Р Н К
практически не с о д е р ж а л и радиоактивности . Степени ковалентного при-
соединения [ 3 5 S]рибосомных белков к р Р Н К приведены в таблице. Вид-
но, что как в изолированных 70S рибосомах, т ак и в комплексе иници-
ации степень «пришивки» p-ys"] белков к 16S р Р Н К несколько выше, чем
к 23S pPHIy. Кроме того, з аметна тенденция уменьшения степени «при-
ISSN 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. Kq 3 55
Рис. 1. Электрофореграмма [3 5S] рибосомных белков, сшитых с рРНК после обработки
70S [3 5S]рибосом Pt2AmCl4: а— в 30S субчастицах; б — в 60S субчастицах; в — в сши-
тых (30S — 50S) субчастицах (1, 2 — кислые и основные белки соответственно). Радио-
автограф
Fig. 1. Identification by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of [ 3 5S]pro-
teins cross-linked to rRNA after the treatment of 70S [3 5S] ribosomes with Pt2AmCl4:
a — in 30S subunits; б — in 60S subunits; в — in (30S-50S) intersubunit cross-links
(1, 2 — acid and basic proteins, respectively). Autoradiography of the gel
Степень ковалентного присоединения [35S] белков к рРНК в свободных рибосомах
и в составе комплекса инициации при обработке Pt2AmCl4
Extent of covalent attachment of [35S] proteins to rRNA in free ribosomes
and in the initiation complex after the treatment with Pt2AmCl4
Состояние 70S
рибосом Субчастицы
Степень
присоеди-
нения, %
Состояние 70S
рибосом
I
Cyбчастицы
Степень
присоеди-
нения, %
Свободные (30S—50S) 41
50 S 29
30S 36
Комплекс ини- (30'S—50S) 33
циации 50S 26
I 30S 31
П р и м е ч а н и е . За 100% принято общее содержание радиоактивности в белках.
ш и в к и » б е л к о в к р Р Н К в с о с т а в е к о м п л е к с а и н и ц и а ц и и п о с р а в н е н и ю
с о с в о б о д н ы м и р и б о с о м а м и . Ф р а к ц и и , с о о т в е т с т в у ю щ и е р Р Н К - б е л к о -
в ы м с ш и в к а м , о б р а б а т ы в а л и 2 M т и о м о ч е в и н о й п р и р Н 3 ,5 . В э т и х у с -
56 ISSN 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. Kq 3 56
Рис. 2. Электрофореграмма [ 3 r , S ] p n -
босомных белков, сшитых с рРНК
после обработки 70S комплекса ини-
циации Pt2AmCl4: а — в 30S субчас-
/ / тицах; о — в 50S субчастицах; в —
в сшитых (30S — 50S) субчастицах.
Радиоавтограф
L28 Fig. 2. Identification by two-dimensio-
β паї polyacrylamide gel electrophoresis
of \3 5S] proteins cross-linked to rRNA
after the treatment of the 70S initiation complex with Pt2AmCl4: a — in 30S subunits;
6 — i n 50S subunits; в — in (30S-50S) intersubunit cross-links. Autoradiography of
л о в и я х сшивки р Р Н К с б е л к а м и полностью р а з р у ш а ю т с я . Н а рис. 1 и
2 представлены результаты а н а л и з а [ 3 5 S] белков, с ш и в а ю щ и х с я с р Р Н К ,
двухмерным гель-электрофорезом. Типичная э л е к т р о ф о р е г р а м м а
[ 3 5 Б ] р и б о с о м н ы х белков после п р о к р а ш и в а н и я геля кумасси приведена
на рис. 3. Следует отметить, что в отдельных экспериментах дополни-
тельным а н а л и з о м кислых белков (см. « М а т е р и а л ы и методы») прово-
дили разделение белков . . . . . ,
L7/L12 и S6. И з р е з у л ь т а т о в , **
представленных на рис. 1 и 2,
видно, что с 16S р Р Н К к а к в .
свободных рибосомах , т а к и в ц
комплексе инициации сшива- "
ются [ 3 5 S] белки, которые
можно р а з д е л и т ь на две груп-
пы по интенсивности пятен на
р а д и о а в т о г р а ф е : 1) L7/L12/S6
(при дополнительном а н а л и з е
Рис. 3. Типичная электрофореграмма
Г355]рибосомных белков после про-
крашивания геля кумасси
Fig. 3. Typical two-dimensional po-
lyacrylamide gel electrophoregram of
P 5 S ] proteins after staining of the gel
with Coomassie
кислых б е л к о в были о б н а р у ж е н ы пятна L7JL12 и S6), Sl и S5 (основ-
ная группа) и 2) S2 — S4, S7 — S9, S14, S18, Li, L13, L14, L19, L22.
С л а б о е пятно белка S12 н а б л ю д а л о с ь только в случае свободных 70S
XSSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. IUsi). Т. 5. № :< 57
рибосом , а б е л к а L21— т о л ь к о в с л у ч а е 70S к о м п л е к с а инициации
( д л я с р а в н е н и я см. рис. 1, α и 2, а ) . А н а л о г и ч н о , белки , с ш и т ы е с 23S
р Р Н К в с в о б о д н ы х рибосома: ; , м о ж н о р а з д е л и т ь на г р у п п ы 1) Li, L2,
Lll, L7/L12 (в этом случае б е л о к So не о б н а р у ж е н ) , LIS, L14, L / о —
L 2 2 , 5 5 и 2 ) 5 / ~ 5 4 , 5 9 , S / 2 - S 1 4 , S20/L26, L 2 5 , L 2 S , Ш .
В составе к о м п л е к с а и н и ц и а ц и и б ы л и и д е н т и ф и ц и р о в а н ы сходные, на-
б о р ы б е л к о в с н е с к о л ь к и м и и с к л ю ч е н и я м и : с л а б ы е п я т н а б е л к о в 5 2 ,
S3 и Slo исчезают , интенсивность пятна L28 ре зко в о з р а с т а е т и появ-
л я ю т с я с л а б ы е п я т н а б е л к о в S18, S19 и L27 (см. рис. 1 , 6 и 2 , о ) . Во
ф р а к ц и и 30S — 50S м е ж с у б ъ е д и н и ч н ы х с ш и в о к (см. рис. I1 в и 2, в)
н а б л ю д а е т с я более в ы р а ж е н н а я р а з н и ц а м е ж д у н а б о р а м и белков , сши-
тых с р Р Н К в с в о б о д н ы х р и б о с о м а х и в составе к о м п л е к с а и н и ц и а ц и и :
с л а б ы е п я т н а б е л к о в S2, S3, S7, S12, S18, LlO, L19, L29 н а б л ю д а ю т с я
т о л ь к о в с л у ч а е к о м п л е к с а и н и ц и а ц и и , в то в р е м я к а к интенсивное пят-
но L2—только в с л у ч а е с в о б о д н ы х рибосом. Н а л и ч и е б е л к о в 30S
с у б ч а с т н ц ы , с ш и т ы х с 23S р Р Н К , во ф р а к ц и и 50S с у б ч а с т и ц и б е л к о в
50S с у б ч а с т н ц ы , с ш и т ы х с 16S р Р Н К , во ф р а к ц и и 30S с у б ч а с т и ц сви-
д е т е л ь с т в у е т о том, что при д и с с о ц и а ц и и 70S рибосом белки одной
с у б ч а с т и ц ы , с ш и т ы е с р Р Н 1 \ другой субчастнцы, о т р ы в а ю т с я от «сво-
ей» с у б ч а с т и ц ы и п е р е х о д я т в д р у г у ю , с р Р Н К которой они к о в а л е н т -
но с в я з а н ы .
М о д и ф и к а ц и и п л а т и н о в ы м и р е а г е н т а м и м о ж е т п о д в е р г а т ь с я ц е л ы й
р я д ф у н к ц и о н а л ь н ы х групи в р Р Н К и б е л к а х , р е а к ц и о н н а я способность
к о т о р ы х при р Н я ^ 7 у б ы в а е т с л е д у ю щ и м о б р а з о м : N7 ( G ) > N 7 ;
N l ( A ) > N 3 ( C ) > N 3 (U) в р Р Н К и - S C H 3 (Me t ) > — S H (Cys ) >
> N ( H i s ) > — N H 2 (Lvs ) — в б е л к а х [2, 3 ] . К а к видно из т а б л и ц ы об-
р а б о т к а [ 3 5 S ] 7 0 S рибосом и к о м п л е к с а и н и ц и а ц и и [ 3 5 S ] 7 0 S рибосо-
м а · A U G U 6 - f M e t - T P H K M e t f 1 м М P t 2 A m C l 4 п р и в о д и т к о б р а з о в а н и ю
р Р Н К - б е л к о в ы х с ш и в о к с высоким в ы х о д о м . О б р а з о в а н н ы е п л а т и н о в ы -
ми с о е д и н е н и я м и п р о д у к т ы с ш и в о к устойчивы в у с л о в и я х в ы д е л е н и я и
а н а л и з а , но л е г к о р а с щ е п л я ю т с я в м я г к и х у с л о в и я х под д е й с т в и е м тио-
м о ч е в и н ы . П р и этом происходит п о л н а я д е м о д и ф и к а ц и я с ш и т ы х ф р а г -
м е н т о в б е л к о в и н у к л е и н о в ы х кислот .
Н а б о р ы б е л к о в , с ш и в а ю щ и х с я с 16S и 23S р Р Н К с п о м о щ ь ю
P t 2 A m C l 4 в с в о б о д н ы х р и б о с о м а х и в к о м п л е к с е инициации , н е с к о л ь к о
р а з л и ч а ю т с я . Р а з л и ч и я к а с а ю т с я , в основном, н а б о р о в белков , Ι Γ Ό Ι Ο -
щ и х о т н о с и т е л ь н о н и з к у ю интенсивность пятен на р а д и о а в т о г р а ф а х (см.
рис . 1 и 2 ) , и, п о - в и д и м о м у , о т р а ж а ю т н е з н а ч и т е л ь н ы е изменении в
р Р Н К - б е л к о в ы х к о н т а к т а х , п р о и с х о д я щ и е в рибосоме при в з а и м о ;сп-
ствии с м а т р и ц е й и и н и ц и а т о р н о й т Р Н К . О д н а к о следует у ч и т ы в а т ь ,
что н е к о т о р ы е р Р Н К - б е л к о в ы е сшивки , п о я в л я ю щ и е с я в к о м п л е к с е ини-
ц и а ц и и , но о т с у т с т в у ю щ и е в с в о б о д н ы х 70S р и б о с о м а х , могут б ы т ь не
с в я з а н ы с и з м е н е н и е м р Р Н К - б е л к о в ы х к о н т а к т о в и о с у щ е с т в л я ю т с я че-
р е з т Р Н К ( сшивки р Р Н К - т Р Н К - б е л о к ) .
Н е д а в н о б ы л и о б н а р у ж е н ы с ш и в к и б е л к о в 5 5 , S4, Sll, 5 1 3 / 5 1 4 ,
S18 с 16S р Р Н К при о б р а б о т к е 30S с у б ч а с т и ц т р а н с - д и а м и п о д и х л о р -
п л а т и н о й [ 4 ] . Б е л к и 5 5 , S4, S14, S18 в х о д я т в набор белков , с ш и в а ю -
щ и х с я с 16S р Р Н К с п о м о щ ь ю P t 2 A m C l 4 в с в о б о д н ы х р и б о с о м а х и в
к о м п л е к с е и н и ц и а ц и и . Очевидно , что и с п о л ь з о в а н и е р е а г е н т а Pi-Ai i iCl 4 ,
о б л а д а ю щ е г о гибкой мостиковой группой ( р а с с т о я н и е м е ж д у с ш и т ы м и
ф у н к ц и о н а л ь н ы м и г р у п п а м и б и о п о л и м е р о в ~ 1,5 и м ) , о т к р ы в а е т воз-
м о ж н о с т ь п о л у ч е н и я д р у г и х в а р и а н т о в с п е ц и ф и ч е с к и х с ш и в о к гю с р а в -
нению с т р а н с - д и а м и н о д и х л о р п л а т и н о й [4 ] , и м е ю щ е й ж е с т к о е линей-
ное строение ( р а с с т о я н и е м е ж д у с ш и т ы м и г р у п п а м и ~ 0 , 5 и м ) .
Х и м и ч е с к и е с ш и в к и б е л к о в Ll, L27 и L29 с 23S р Р Н К были извест-
ны р а н е е (см. о б з о р ы [1, 1 5 ] ) , о с т а л ь н ы е 23S р Р Н К - б е л к о в ы е с ш и в к и
о б н а р у ж е н ы в п е р в ы е . Н е п о с р е д с т в е н н о е соседство б е л к о в 55 , S4. S7,
S9, S18 с 16S р Р Н К и б е л к о в Llj L2 с 23S р Р Н К р а н е е б ы л о установ-
л е н о м е т о д о м п р я м ы х У Ф - и н д у ц и р о в а н н ы х с ш и в о к I 9, 10, 16]. Р я д дан -
н ы х по х и м и ч е с к и м с ш и в к а м п о д т в е р ж д а е т соседство б е л к о в Si, S4,
5 7 , 5 5 и S12 с 16S р Р Н К [1, 15, 1 7 / 1 8 ] . П р я м о й к о н т а к т б е л к а Li с
58 ISSN 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. Kq 3 58
16S р Р Н К р а н е е н а б л ю д а л и в р а б о т е [ 1 0 ] п р и У Ф - о б л у ч е н и и к а к и з о -
л и р о в а н н ы х 7 0 S р и б о с о м , т а к и п р е - и п о с т т р а н с л о к а ц и о н н ы х к о м п л е к -
с о в . Д а н н ы е по с ш и в к а м б е л к а L l с 16S р Р Н К х о р о ш о с о г л а с у ю т с я с
с о о т в е т с т в у ю щ и м и м о д е л я м и 7 0 S р и б о с о м ы , с о г л а с н о к о т о р ы м « г о л о в -
к а » 3 0 S с у б ч а с т и ц ы гесно п р и м ы к а е т к р е б р у Ll [19, 2 0 ] . С ш и в к и б е л -
к а L7/L12 с 16S р Р Н К р а н е е не н а б л ю д а л и . В о з м о ж н о , с ш и в к а э т о г о
б е л к а с 16S р Р Н К п р о и с х о д и т ч е р е з о д и н из б е л к о в 3 0 S с у б ч а с т и ц ы ,
с ш и в а ю щ и х с я с 16S р Р Н К . О д н а к о п р и и з у ч е н и и б е л о к - б е л к о в ы х к о н -
т а к т о в в с о с т а в е 7 0 S р и б о с о м с п о м о щ ь ю р а з л и ч н ы х б и ф у н к ц и о н а л ь -
н ы х р е а г е н т о в с ш и в к и б е л к а L7/L12 с б е л к а м и 3 0 S с у б ч а с т и ц не б ы л и
з а р е г и с т р и р о в а н ы ни р а з у . П о э т о м у в е р о я т н е е всего , что б е л о к L7/L12
с ш и в а е т с я н е п о с р е д с т в е н н о с 16S р Р Н К . С л е д о в а т е л ь н о , м о ж н о п р е д -
п о л о ж и т ь , что « с т е р ж е н ь » L7/L12 ( о д и н из д и м е р о в L7/L12) п р и м ы к а -
ет к о д н о м у из у ч а с т к о в 16S р Р Н К ( р а с с т о я н и е < 1,5 н м ) к а к в сво -
б о д н ы х 7 0 S р и б о с о м а х , т а к и в к о м п л е к с е р и б о с о м с м а т р и ц е й и и н и -
ц и а т о р н о п т Р Н К .
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Brimucombe R., Stiege W7. Structure and function of ribosomal RNA/ /Biochcm. J.—
1985 .—229 , \ 1 . — P . 1—17.
2. Cruss,ia!?i;if.> of chromosomal proteins to DNA in HeLa cells by UV, gamma radiati-
on and Sfiinri antitumor drugs / Ζ. M. Banjar, L. S. Hnilica, R. C. Briggs ct al. / /
Biochcm. aiitl Biophys. Res. C o m m u n s - 1983.—114, N 2,—P. 767—773.
3. Jn vivo effect οι cis- and trans-diamminedichloroplatinum (II) on SV40 chromosomes
differential repair, DNA-protein cross-linking and inhibition of replication / R. B. Cic-
carcli , M. Л. Solomon, A. Varshavsky, S. I. Lippard/ /Biochemistry.— 1985.—24,
N 26.— P. 7533—7540.
4. Trans-iliamminedichlorophitinum (II), a reversible RNA-protein cross-linking agent.
Application to the ribosome and an aminoacyl-tRNA synthetase / tRNA complex/
M. A. Tukalo, M. D. Kuller, D. Kern et a l . / / I b id .— 1987.—26, N 16.—P. 5200—
5208.
5. Платиновые производные — сшивающие реагенты для исследования взаимодействия
тРНК с аминоацил-тРНК синтетазами / М. А. Тукало, О. Т. Рожко, Г. X. Мацука
и д р . / / Д о к л . АН СССР.— 1985,—280, № 6.—С. 1484—1487.
6. Cross-linking of initiation factor IF-3 to E. coli 30S ribosomal subunits by trans-
diamminedichloroplatinum (II): characterization of two cross-linking sites in 16S
RNA, a possible wav of functioning for IF-3 / C. Ehresmann, H. Moine, M. Mougel
ct al. / / Nuc 1. Acids Res.— 1986.—14, N 2,—P. 4803—4821.
7. Crosslinking of elongation factor Tu to tRNA P h e by irnns-diammirodichloroplatinum
(II). Characterization of two cross-linkine- sites in the IRNA / E. P. Wikman, P. Rom-
bv, M. H. Metz ct al. / / I b i d — 1987.—15.' X U - R 5787—5801.
8. Применение сшивающих платиновых реагентов л л я изучения взаимодействия тРНК
и мРНК с рибосомами / С. Н. Владимиров, Д. М. Грайфер, М. А. Зенкова и д р . / /
Биоорг. химия — 1987,—13, ЛЬ 8,—С 1053—1058.
9. Контакты рпбосомпых белков с TPHK p h c и 16S РНК в аналогах 30S ипициптор-
ного комплекса / Г. Г. Абдуплпгидова, Μ. Г Илпгизян, Н. В. Pwienxo Jf др. / / Мо-
лекул яр. биология,— 1985—19. N° 2 —С. 553—557.
10. Jnfcrsuhunif RNA-protein contacts in pre- and posttranslocated Ε. coli r ibosome/
G. G. Abdurashidova, Ε. A. Tsvetkova, A. A. Chernyi et a l . / / F E B S Lett.— 1985.—
185, N 2,—P. 291—294.
11. Получение 70S рибосом Escherichia coli, меченных 3r,S../M. Абдукяюмов, О. И. Гн-
маутдинова, Д. М. Грайфер и др. / /Биохимия.— 1987.—52. ,Nb 9.— С. ! 411 -14 '5.
12. Исследование мРНК-связывающей области рибосомы на равных эта них тпап'угчтни.
1. Функциональная активность аналогов мРНК ·—At ,'Gl1. и е~о Ґ.ОІГИ'ЛЧЛЄИОРЬІХ
производных — в рибосом поза висимом белковом гни ι о Ό ·' Г. Т. Г а̂Гі нтт;.;̂ Г. Г Кар-
пова, В. А. Берзииь и др. / / Биоорг. химия— 1983 . • 9, Mi 11.·—С -535 --15'3.
13. Власов В. В., Казаков С. А.. Muroeeu В. Г. Синтез двугмерных -тппонттй П ИП)
с NhNhNhNx-TeTpaKnc (2-амщ-ю^тил) -1.6-гекеа метилен тиамином U Док л Λ H СССР.—
1082.·—266, .Nb 4 — С. 866—870.
14. The proteins of the messenger RNA blading site of Escherichia coli ribosomcs /
О. I. Gimaiitdinova, G. G. Karpova, D. G. Knorre, Nh D. Kobe tz / /Nuc l . Acids Res.—
1P81.—9, N 4,—P. V.65—3481.'
15. RNA structure and RNA-protein neighbourhoods in the r ibosome/R . Brimacombe,
J. Atmadja, A. Kvriatsotilis. Wh S t i eee / /S t ruc tu re , function and genetics o" riboso-
mcs / Eds B. Hardcsty, G. Kramer — New York: Springer, 1986.—P. 184—202.
16. Induction of polynucieotide-protein cross-linkages by ultraviolet irradiation. Peculia-
rities of the І1І9-І1 intensity laser pulse irradiation / Ε. I. Budowskv, M. S. Axentieva,
G. Ci. Abdurashidova et a l . / / E u r . J. Biochem.—1986 —159, N 1,—P. 95—101.
17. Identification of 16S RNA fragment crosslinked to protein Sl within E. coli riboso-
mal 30S subunits by use of a cross-linking reagent — ethyl-4-azidobenzoylaminoaceti-
ISSN 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. Kq 3 59
m i d a t e / B . Golcnska, R. Millon, C Backendori et al. / / Ibid.— 1 9 8 1 1 1 5 , N З,—
P. 479—484.
18. Cross-linking between 16S ribosomal RNA and protein S4 in Escherichia coli riboso-
mal 30S subunits effected by treatment with bisulfite/hydrazine and bromopyruvale /
N. Nitta1 0 . Kuge, S. Yui et a l . / / I b i d . — 1986.—157, N 3,—P. 427—432.
19. Stofjler G., Stofjler-Meilicke M. Immuno electron microscopy on Escherichia coli
r ibosomes/ /S t ruc ture , function, and genetics of ribosomes / Eds B. Hardesty,
G. Kramer.—New York: Springer, 1986.—P. 28—46.
20. Ribosome structure, function, and evolution: mapping ribosomal RNA, proteins, and
functional sites in three dimensions / M. Oakcs, E. Henderson, A. Scheinman et
a ! . / / I b i d . — P . 47—67.
Ин-Т биоорг. химии Сиб. отд-ния АН СССР, Получено 03.05.88
Новосибирск
rRNA-PROTEIN INTERACTIONS IN ESCHERICHIA COLI 70S RIBOSOMES
AND IN COMPLEX OF INITIATION BY DATA OF CROSS-LINKS
WITH BIFUNCTIONAL Pt( I I ) DERIVATIVE
P. G. Chistnakov, M. Abdukayumov, A. G. Venyaminova, S. N. Vladimirov,
D. M. Graifer, S. A. Kazakov, G. G. Karpova
Institute of Bioorganic Chemistry,
Siberian Branch of the Academy of Sciences of the USSR, Novosibirsk
S u m m a r y
rRNA-protein cross-links in 70S 35S-Iabelled ribosomes in the free state and within ini-
tiation complex ribosome·AUGU6-fMet-tRNAfM e t were investigated using bifunctional
cleavable reagent {dichloro [N5N5Nr
5N^tetrakis- (2-aminoethyl)-1.6-hexamethylendiamine-
diplatinum (II)]}dichloride. The sets of proteins cross-linked to 16S and 23S rRNA in
free 70S ribosomes and in 70S initiation complex were shown to slightly differ. It was
found that one of L7/L12 dimers borders on one of 16S rRNA sites (a distance ^ 1 , 5 nm)
both in free ribosomes and in initiation complex.
У Д К 547.963.3
Д . Б . Д о р о х о в , В . Б . Одинцов. С. В . К и р и л л о в
М А Т Р И Ч Н О З А В И С И М О Е С В Я З Ы В А Н И Е А М И Н О А Ц И Л - т Р Н К
С А - У Ч А С Т К О М 7 0 S Р И Б О С О М ESCHERICHIA COLI
В О Т С У Т С Т В И Е Т Р А Н С П Е П Т И Д А Ц И И
Измерены константы ассоциации Phe-TPHKvhe с А-участком 70S рибосом в условиях
блокирования ее связывания с P-участком деацилированной TPHKphe. Но зависимости
величины константы ассоциации от температуры рассчитаны энтальпия (SH° ~ Jl ккал/
моль) и энтропия (AS0~—5 кал-моль-1 - град-1) этого взаимодействия. Константа ас-
социации Phe-TPHKphe, измеренная при O0C и блокировании Р-участка нерасщепляе-
мым аналогом пептидил-тРНК, хорошо согласуется с этой зависимостью. Около двух
ионов магния прямо или опосредованно принимают участие в матричнозависимом вза-
имодействии Phe-TPHKphe с А-участком 70S рибосом.
В в е д е н и е . П о л у ч е н и е к о л и ч е с т в е н н ы х д а н н ы х о в з а и м о д е й с т в и и а м и н о -
а ц и л - т Р Н К с А - у ч а с т к о м р и б о с о м ы п р е д с т а в л я е т б о л ь ш о й и н т е р е с , т а к
к а к и м е н н о о н о о б е с п е ч и в а е т , п о - в и д и м о м у , т о ч н о с т ь о т б о р а о ч е р е д н о й
а м и н о к и с л о т ы в п р о ц е с с е э л о н г а ц и и и, к а к с л е д с т в и е , в ы с о к у ю т о ч н о с т ь
т р а н с л я ц и и . О д н а к о д о н а с т о я щ е г о в р е м е н и не п о л у ч е н о не т о л ь к о с р а в -
н и т е л ь н ы х ф и з и к о - х и м и ч е с к и х х а р а к т е р и с т и к в з а и м о д е й с т в и я б л и з к и х
по к о д о в ы м с в о й с т в а м а м и н о а ц и л - т Р Н К с А - у ч а с т к о м к о м п л е к с а р и б о -
с о м а — м а т р и ц а , но и не р а с с ч и т а н ы т е р м о д и н а м и ч е с к и е п а р а м е т р ы
в з а и м о д е й с т в и я с о о т в е т с т в у ю щ е й к о д о н у а м и н о а ц и л - т Р Н К с А - у ч а с т -
к о м в у с л о в и я х р а в н о в е с и я . Т р у д н о с т ь с о с т о и т в в ы б о р е с и с т е м ы д л я
е г о и з м е р е н и я .
Р а н е е б ы л о п о к а з а н о , ч т о P h e - T P H K p h e о б л а д а е т б о л ь ш и м с р о д -
с т в о м к Р - у ч а с т к у к о м п л е к с а [ 7 0 5 + п о л и ( U ) ] , ч е м к Α - у ч а с т к у , и п р и
60 ISSN 0233-7057. Б И О П О Л И М Е Р Ы И КЛЕТКА. 1989. Т. 5. Kq 3 60
|