Изучение особенностей синтеза альфа-2b интерферона человека в клетках Escherichia coli при различных условиях культивирования

Изучение особенностей синтеза альфа-2b интерферона человека в клетках Escherichia coli при различных условиях культивирования

Исследовано влияние на уровень синтеза альфа-2b интерферона (ИФН) человека в клетках Е. coli SG30 (pIF-16) наличия в питательной среде глюкозы и мальтозы, а также температуры культивирования продуцента. Продуцент ИФН содержит плазмиду pIF-16, несущую тандем искусственных генов ИНФ. Конститутивную эк...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Datum:2002
1. Verfasser: Славченко, И.Ю.
Format: Artikel
Sprache:Ukrainian
Veröffentlicht: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2002
Schriftenreihe:Біополімери і клітина
Schlagworte:
Молекулярна та клітинна біотехнології
Online Zugang:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155824
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Изучение особенностей синтеза альфа-2b интерферона человека в клетках Escherichia coli при различных условиях культивирования / И.Ю. Славеченко // Вiopolymers and Cell. — 2002. — Т. 18, № 2. — С. 164-170. — Бібліогр.: 30 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155824
record_format dspace
spelling nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1558242025-02-09T23:53:36Z Изучение особенностей синтеза альфа-2b интерферона человека в клетках Escherichia coli при различных условиях культивирования Вивчення особливостей синтезу альфа-2b інтерферону людини в клітинах Escherichia coli при різних умовах культивування Investigation the influence of cultivation conditions on production of human alpha-2b interferon in Escherichia coli Славченко, И.Ю. Молекулярна та клітинна біотехнології Исследовано влияние на уровень синтеза альфа-2b интерферона (ИФН) человека в клетках Е. coli SG30 (pIF-16) наличия в питательной среде глюкозы и мальтозы, а также температуры культивирования продуцента. Продуцент ИФН содержит плазмиду pIF-16, несущую тандем искусственных генов ИНФ. Конститутивную экспрессию этих генов обеспечивает тандем триптофановых промоторов. В результате исследований выявлено, что при выращивании клеток Е. coli SG30 (pIF-16) при температуре 37 °С в среде, содержащей в качестве источников углерода мальтозу или глюкозу, может существенно снижаться уровень выхода ИФН по сравнению со средой без добавления этих сахаров. Показано, что выход ИФН зависит от температуры культивирования продуцента и концентрации данных сахаров в питательной среде. Глюкоза оказывает негативное влияние на синтез ИФН в более низких концентрациях, чем мальтоза. Установлено, что добавление мальтозы в культуральную среду обеспечивает более высокий выход биомассы, чем добавление глюкозы, при выращивании клеток штамма-продуцента Е. coli SG30 (plF-lb) как при температуре 37, так и 28 °С. Досліджено вплив на рівень синтезу альфа-2b інтерферону (ІФН) людини в клітинах Е. coli SG30 (pIF-16) наявності у поживному середовищі глюкози і мальтози, а також темпера­тури культивування продуцента. Продуцент ІФН містить плазміду pIF-16, яка несе тандем штучних генів ІФН. Кон­ститутивну експресію цих генів забезпечує тандем триптофанових промоторів. У результаті досліджень виявлено, що при вирощуванні клітин Е. coli SG30 (pIF-16) при темпера­турі 37 °С у середовищі, що містить як джерела вуглецю мальтозу або глюкозу, може суттєво знижуватися рівень виходу ІФН порівняно з середовищем без додавання цих цукрів. Показано, що вихід ІФН залежить від температури культиву­вання продуцента та концентрації даних цукрів у поживному середовищі. Глюкоза виявляє негативний вплив на синтез ІФН у нижчих концентраціях, ніж мальтоза. Встановлено, що додавання мальтози до культурального середовища забезпечує більш високий вихід біомаси, ніж додавання глюкози, при вирощуванні клітин штама-продуцента Е. coli SG30 (pIF-16) як при температурі 37, так і 28 °С. The influence of glucose and maltose presence in a growth medium, as well as the temperature of producer cultivation on the production level of the human alpha-2b interferon (1FN) in E. coli have been studied. E. coli SG30 (pIF-16) harbouring plasmid pIF-16 bearing tandem of the artificial IFNs genes under the control of the trp promoters' tandem has been used as strain-producer of IFN. Results indicate that during E. coli SG30 (pIF-16) cells cultivation at 37 degrees C in the presence of maltose or glucose as carbone sourse in growth medium the yield of IFN was appreciably decreased in comparison with carbons – free medium. We have also demonstrated that the level of IFN production depends on the concentration of these carbons in a medium and the cultivation temperature of producer. Glucose exerts negative influence on synthesis IFN In lower concentration, than maltose. It was shown this study, that the addition of maltose to the medium resulted higher yield of cells biomass, than the addition of glucose during growth E. coli SG30 (pIF-16) both 37, and 28 degrees C. 2002 Article Изучение особенностей синтеза альфа-2b интерферона человека в клетках Escherichia coli при различных условиях культивирования / И.Ю. Славеченко // Вiopolymers and Cell. — 2002. — Т. 18, № 2. — С. 164-170. — Бібліогр.: 30 назв. — укр. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0005FA https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155824 579.258 + 579.69 uk Біополімери і клітина application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Ukrainian
topic Молекулярна та клітинна біотехнології
Молекулярна та клітинна біотехнології
spellingShingle Молекулярна та клітинна біотехнології
Молекулярна та клітинна біотехнології
Славченко, И.Ю.
Изучение особенностей синтеза альфа-2b интерферона человека в клетках Escherichia coli при различных условиях культивирования
Біополімери і клітина
description Исследовано влияние на уровень синтеза альфа-2b интерферона (ИФН) человека в клетках Е. coli SG30 (pIF-16) наличия в питательной среде глюкозы и мальтозы, а также температуры культивирования продуцента. Продуцент ИФН содержит плазмиду pIF-16, несущую тандем искусственных генов ИНФ. Конститутивную экспрессию этих генов обеспечивает тандем триптофановых промоторов. В результате исследований выявлено, что при выращивании клеток Е. coli SG30 (pIF-16) при температуре 37 °С в среде, содержащей в качестве источников углерода мальтозу или глюкозу, может существенно снижаться уровень выхода ИФН по сравнению со средой без добавления этих сахаров. Показано, что выход ИФН зависит от температуры культивирования продуцента и концентрации данных сахаров в питательной среде. Глюкоза оказывает негативное влияние на синтез ИФН в более низких концентрациях, чем мальтоза. Установлено, что добавление мальтозы в культуральную среду обеспечивает более высокий выход биомассы, чем добавление глюкозы, при выращивании клеток штамма-продуцента Е. coli SG30 (plF-lb) как при температуре 37, так и 28 °С.
format Article
author Славченко, И.Ю.
author_facet Славченко, И.Ю.
author_sort Славченко, И.Ю.
title Изучение особенностей синтеза альфа-2b интерферона человека в клетках Escherichia coli при различных условиях культивирования
title_short Изучение особенностей синтеза альфа-2b интерферона человека в клетках Escherichia coli при различных условиях культивирования
title_full Изучение особенностей синтеза альфа-2b интерферона человека в клетках Escherichia coli при различных условиях культивирования
title_fullStr Изучение особенностей синтеза альфа-2b интерферона человека в клетках Escherichia coli при различных условиях культивирования
title_full_unstemmed Изучение особенностей синтеза альфа-2b интерферона человека в клетках Escherichia coli при различных условиях культивирования
title_sort изучение особенностей синтеза альфа-2b интерферона человека в клетках escherichia coli при различных условиях культивирования
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate 2002
topic_facet Молекулярна та клітинна біотехнології
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155824
citation_txt Изучение особенностей синтеза альфа-2b интерферона человека в клетках Escherichia coli при различных условиях культивирования / И.Ю. Славеченко // Вiopolymers and Cell. — 2002. — Т. 18, № 2. — С. 164-170. — Бібліогр.: 30 назв. — укр.
series Біополімери і клітина
work_keys_str_mv AT slavčenkoiû izučenieosobennosteisintezaalʹfa2binterferonačelovekavkletkahescherichiacoliprirazličnyhusloviâhkulʹtivirovaniâ
AT slavčenkoiû vivčennâosoblivosteisintezualʹfa2bínterferonulûdinivklítinahescherichiacolipriríznihumovahkulʹtivuvannâ
AT slavčenkoiû investigationtheinfluenceofcultivationconditionsonproductionofhumanalpha2binterferoninescherichiacoli
first_indexed 2025-12-01T23:14:05Z
last_indexed 2025-12-01T23:14:05Z
_version_ 1850349559148969984
fulltext ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2002. Т. 18. № 2 МОЛЕКУЛЯРНА І КЛІТИННА БІОТЕХНОЛОГІЇ Изучение особенностей синтеза альфа-2Ь интерферона человека в клетках Escherichia coli при различных условиях культивирования И. Ю. Славченко ПНИК «Биотехнолог» Ул. Академика Заболотного, 150, Киев, 03143 , Украина Исследовано влияние на уровень синтеза альфа-2b интерферона (ИФН) человека в клетках Е. coli SG30 (pIF-16) наличия в питательной среде глюкозы и мальтозы, а также температуры культивирования продуцента. Продуцент ИФН содержит плазмиду pIF-16, несущую тандем искусственных генов ИНФ. Конститутивную экспрессию этих генов обеспечивает тандем триптофановых промоторов. В результате исследований выявлено, что при выращивании клеток Е. coli SG30 (pIF-16) при температуре 37 °С в среде, содержащей в качестве источников углерода мальтозу или глюкозу, может существенно снижаться уровень выхода ИФН по сравнению со средой без добавления этих Сахаров. Показано, что выход ИФН зависит от температуры культивирования продуцента и концентрации данных Сахаров в питательной среде. Глюкоза оказывает негативное влияние на синтез ИФН в более низких концентрациях, чем мальтоза. Установлено, что добавление мальтозы в культуральную среду обеспечивает более высокий выход биомассы, чем добавление глюкозы, при выращивании клеток штамма-продуцента Е. coli SG30 (plF-lb) как при температуре 37, так и 28 °С. Введение. Существующие подходы для достижения высокого уровня экспрессии чужеродных генов в Е. coli позволяют исследователям целенаправленно конструировать рекомбинантные штаммы бактерий с прогнозируемыми свойствами (см., например, обзоры [1—3]) . Уровень синтеза целевого продукта определяется удачным выбором продуцента, типа вектора, дизайна целевого гена, а также регулятор­ них элементов, способных обеспечить его эффек­ тивную транскрипцию и трансляцию соответствую­ щей мРНК. Выход рекомбинантного белка во мно­ гом зависит от условий культивирования продуцен­ та — температурного режима ведения процесса, аэрации, рН, состава питательной среды и других факторов, поскольку они оказывают влияние на все ступени реализации генетической информации. Например, и температура, и состав питательной среды могут дифференцированно влиять на ини­ циацию трансляции индивидуальных мРНК К coli [4] . Эти и другие параметры могут обусловливать © И. Ю. СЛАВЧЕНКО, 2002 и протеолитическую активность в бактериальных клетках [5] , что также сказывается на конечном выходе целевого продукта. Существенное влияние на уровень синтеза рекомбинантного белка могут оказывать величина рН [6—8] и количество рас­ творенного кислорода в культуральной среде [6, 9 ]. В литературе также широко представлены данные, демонстрирующие зависимость биосинтеза белков от скорости роста бактериальных клеток (напри­ мер, [9—11]) . Кроме того, конечный выход целе­ вого продукта определяется общим количеством полученной биомассы из единицы объема [12, 13]. Последние параметры, прежде всего, обеспечива­ ются составом питательной среды, в частности, используемым в качестве источника углерода и энергии веществом. Как правило, исследователи останавливают свой выбор на глюкозе [12—15], хотя есть примеры успешного применения и других Сахаров, таких как мальтоза [16] , фруктоза [17] , галактоза [16], арабиноза [18] . Манипулируя составом питательной среды, ис­ следователи разрабатывают новые подходы для увеличения вклада растворимой фракции рекомби- 164 ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ СИНТЕЗА АЛЬФА-2 ИНТЕРФЕРОНА нантного белка. Так, в литературе описано, что выращивание клеток штамма-продуцента в услови­ ях осмотического стресса (например, 4 % NaCl) в присутствии веществ, стабилизирующих белок, в частности, глицерина, сорбита, глицинбетаина и др. может способствовать накоплению целевого продукта в клетках в растворимом виде [19, 20 ] . Существуют и другие подходы для получения ре- комбинантных белков в растворимом состоянии, например, использование в биотехнологических процессах бактериофага лямбда, обеспечивающего лизис бактериальных клеток и накопление целево­ го продукта в растворимой форме в культуральной среде. Такая система, разработанная нами для получения альфа-2а интерферона человека в клет­ ках Е. coli [21 ], является перспективной для полу­ чения и других генно-инженерных продуктов эука- риотического происхождения, в частности, альфа- 2Ь интерферона человека. Цель настоящей работы состояла в изучении влияния на уровень синтеза альфа-2Ь интерферона (ИФН) человека наличия в составе питательной среды в качестве источников углерода глюкозы и мальтозы, а также температурных условий культи­ вирования продуцента. Материалы и методы. В работе использованы следующие бактериальные культуры: устойчивый к фагу лямбда штамм Е. coli SG20050 (pIF-16) recA OF", araD139, A(argF-lac)UJ69, flbB5301, deoCl, rpsL150, relAJ, Alon-JOO, cps-50::Mu dl) получен от В. Г. Коробко (Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина, Россия). Штаммы Е. coli SG30 и SG30 (pIF-Ш являются его производными, чувствительными к фагу лямбда, и получены в ходе манипуляций, описанных в работах [22, 23 ]. Рекомбинантная плазмида pIF-16> несущая ге­ ны ИФН, содержит в качестве генетического мар­ кера ген Ыа (^8-лактамазы), обеспечивающий ус­ тойчивость трансформированных клеток к ампи­ циллину. Среды. Для выращивания бактериальных куль­ тур использовали питательную среду LB [24] , со­ держащую ампициллин в конечной концентрации 20 мкг/мл. В зависимости от условий эксперимента в среду добавляли 20 %-й раствор глюкозы или мальтозы до конечных концентраций 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 % (w/v). Культуры поддерживали на чашках Петри с агаризованной средой LB с ампициллином без до­ бавления Сахаров. Концентрация агара в среде составляла 1,5 %. Для определения уровня синтеза ИФН плазми- досодержащие клетки Е. coli выращивали в пробир­ ках с 2 мл питательной среды на качалке в условиях интенсивной аэрации (160 об/мин) при температуре 37 или 28 °С в течение 18 ч. Среды засевали предварительно полученным инокулятом. Инокулят выращивали в термостате при темпера­ туре 37 °С в течение ночи. Соотношение объема инокулята к объему среды составляло 1:10. Выход биомассы определяли по оптической плотности (ОП) на фотоколориметре КФК-3 (Рос­ сия) при А - 540 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Для электрофоретического анализа суммарных белков клетки пробы готовили следующим образом. Предварительно определяли объем клеточной сус­ пензии, из которой следует собирать биомассу цен­ трифугированием в зависимости от ОП культуры (из расчета 200 мкл при ОП 5 ,0) . Затем клетки из этого объема клеточной суспензии осаждали при 14000 об/мин в течение 5 мин и ресуспендировали в 50 мкл буфера для нанесения (5 %-й глицерин, 3 %-й додецилсульфат натрия (SDS), 2 %-й 2-мер- каптоэтанол, 0,02 %-й бромфеноловый синий). Пробы выдерживали 5 мин при температуре 100 °С и по 10 мкл наносили на полиакриламидный гель (ПААГ). Электрофорез белков осуществляли по методу Лэммли [25] в 12,5 %-м ПААГ в присутствии 1 %-го SDS с последующим прокрашиванием в растворе кумасси R-250. Процентное содержание ИФН в плазмидосодержащих клетках устанавлива­ ли денситометрированием соответствующих доро­ жек геля с помощью прибора Image Master («Phar- macia Biotech», Швеция). Для определения молеку­ лярной массы (м. м.) белков применяли программу Image Master ID Prime. В качестве стандарта для электрофореза использовали калибровочный набор белков с низкой м. м. («Amersham Pharmacia Bio- tech», Швеция). Набор содержит смесь белков с м. м. 94, 67, 43, 30, 20,1 и 14,4 кДа. Результаты и обсуждение. Для разработки технологии получения альфа-2Ь ИФН человека с использованием бактериофага лямбда нами в каче­ стве продуцента получен чувствительный к этому фагу штамм Е. coli SG30 (pIF-16) [22, 2 3 ] . Этот продуцент содержит плазмиду pIF-16, несущую тандем искусственных генов ИНФ [26 ]. Конститу­ тивную экспрессию этих генов обеспечивает тан­ дем триптофановых промоторов. Плазмида сконст­ руирована таким образом, что трансляция целевых генов происходит по принципу сопряжения в ис­ кусственном полицистроне [27] . Эта плазмида обеспечивает в клетках Е. coli SG20050 высокий уровень конститутивного биосинтеза рекомбинант­ ного белка, однако он накапливается в клетке в нерастворимом состоянии [23, 28 ] и для выделения 165 СЛАВЧЕНКО И. Ю. активного ИФН необходимо осуществлять дезин­ теграцию клеток с последующим получением из телец включений растворимого целевого продукта. Эти процедуры приводят не только к значительным потерям, но и неблагоприятно сказываются на свойствах генно-инженерного продукта, что неже­ лательно при его дальнейшем применении в меди­ цинской практике. Таких технологических сложно­ стей можно избежать при использовании в биотех­ нологических процессах синтеза рекомбинантных белков бактериофага лямбда. Так, наиболее высо­ кий выход альфа-2а ИФН человека достигнут нами в трехкомпонентной системе биосинтеза, основны­ ми элементами которой являются бактериальная клетка, плазмида, несущая целевой ген, и исполь­ зуемый для инфицирования плазмидосодержащих клеток Е. coli фаг лямбда, геном которого также содержит целевой ген [21J. При разработке способов получения биологиче­ ски активных веществ необходимо учитывать меха­ низм их биосинтеза и физиологические особенно­ сти продуцента. Поскольку на выход целевого про­ дукта существенное влияние могут оказывать такие факторы, как состав питательной среды и температурный режим, представлялось целесооб­ разным изучить влияние на уровень экспрессии альфа-2Ь ИФН человека в клетках Е. coli SG30 (pIF-16) наличия в питательной среде мальтозы или глюкозы и определить оптимальную темпера­ туру культивирования продуцента. Выбор именно этих источников углерода и энергии сделан по следующим причинам. При ис­ пользовании в биотехнологических процессах бак­ териофага А очень важно создать оптимальные условия для литического развития фага в заражен­ ных клетках. Адсорбция фага на бактериальной клетке является первым этапом инфекционного процесса. Добавление мальтозы в питательную сре­ ду индуцирует мальтозный оперон, в состав кото­ рого входит ген ІатВ. Продуктом этого гена явля­ ется рецептор фага лямбда, необходимый для его адсорбции на бактериальной клетке. Поэтому при индукции мальтозного оперона добавлением в пи­ тательную среду мальтозы на поверхности клетки резко возрастает количество рецепторов фага А [29 ]. Это способствует эффективности фаговой ин­ фекции и может в значительной мере влиять на выход целевого продукта, который накапливается в культуральной среде в результате лизиса инфици­ рованных фагом клеток. Наличие в составе среды такого эффективного источника углерода и энер­ гии, как глюкоза, также может обеспечивать более высокий выход целевого продукта, поскольку клет­ ке нужны энергия и строительный материал для активного синтеза как целевого продукта, так и фаговых белков. В ходе экспериментов получены неожиданные результаты. Так, установлено, что при выращива­ нии при температуре 37 °С продуцента SG30 (pIF- 16) на среде LB10, содержащей 0,4 % мальтозы, имело место резкое угнетение синтеза ИФН по сравнению с контролем (среда без добавления Саха­ ров). Аналогичный результат получен и в случае добавления в среду глюкозы до конечной концент­ рации 0,4 %. Такое явление не описано в литературе для продуцентов, созданных на основе штамма Е. coli SG20050, в которых экспрессия целевого гена нахо­ дится под контролем триптофановых промоторов. Поскольку это могло быть характерно только для полученного нами As штамма SG30 (pIF-16), мы провели эксперимент по аналогичному протоколу и с исходным продуцентом ИФН Е. coli SG20050 (pIF-16). Электрофоретический анализ показал, что добавление в питательную среду как мальтозы, так и глюкозы практически полностью блокирует синтез ИФН и в клетках штамма Е. coli SG20050 (pIF-16) (рис. 1). Этот результат является подтвер­ ждением того, что исходный штамм Е. coli SG20050 (pIF-16) и полученный нами штамм SG30 (pIF-16) являются изогенными и по этому признаку. Интересным является тот факт, что в клетках, выращенных при температуре 37 °С на средах как с мальтозой, так и с глюкозой, на фоне блокирова­ ния синтеза целевого продукта наблюдается увели­ чение уровня синтеза полипептида с немного боль­ шей молекулярной массой (19 кДа), чем ИФН (18,4 кДа). Это имеет место и в клетках Е. coli SG30 (pIF-Ю, и в клетках Е. coli SG20050 (pIF- 16) (рис. 1). Чтобы установить, связано ли это с наличием в клетках рекомбинантной плазмиды и чужеродно­ го продукта либо является характерной особенно­ стью реципиента, клетки Е. coli SG30, не содержа­ щие плазмиду pIF-16, выращивали при температу­ ре 37 °С на среде с глюкозой (0,4 % ) , мальтозой (0,4 %) и без них, как описано в разделе «Матери­ алы и методы» для плазмидосодержащих клеток, и подвергали электрофоретическому анализу (рис 2) . В результате данного эксперимента показано, что увеличение синтеза полипептида с молекуляр­ ной массой 19 кДа относительно контроля (среда без Сахаров) имеет место и в бесплазмидных клет­ ках Е. coli SG30 при их выращивании на среде с глюкозой или мальтозой (0,4 %) и не связано с наличием в клетках плазмиды и рекомбинантного белка. Как известно, температура культивирования 166 ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ СИНТЕЗА АЛЬФА-2 ИНТЕРФЕРОНА v "ft / 2 З 1 2 З 4 U Рис. 1. Электрофореграмма образцов клеток Е. coli SG20050 \plF-16), выращенных при темпе­ ратуре 37 °С на средах: 1 — LB; 2 — LB с мальтозой (0 ,4 % ) ; 3 — LB с глюкозой (0,4 % ) . Положение ИФН указано стрелкой Рис. 2. Электрофореграмма образцов клеток Е. coli SG30 а—З) и SG30 (pIF-16) (4)у выра­ щенных при температуре 37 °С на средах: У, 4 — LB; 2 — LB с глюкозой (0,4 % ) ; 3 — LB с мальтозой (0 ,4 % ) ; 5 — белки-маркеры. Поло­ жение ИФН указано стрелкой здуцента может оказывать существенное влия- е как на выход биомассы, так и на уровень ітеза целевого продукта. Поэтому в ходе данной юты исследовали влияние на выход биомассы и Е>Н температуры культивирования продуцента 30 (pIF-16) при его выращивании на среде LB І Сахаров, а также с глюкозой (0,4 %) и мальто- I (0,4 % ) . Усредненные результаты, полученные іяти независимых опытах, представлены на рис Установлено, что при температуре 37 °С выход эмассы выше, чем при 28 °С, на всех средах, а енно: на среде LB без Сахаров — в 1,7 раза, на дах с глюкозой (0,4 %) — в 1,3 раза, мальтозой 4 % ) — 1,4 раза. При этом самый низкий выход омассы как при температуре 37, так и 28 °С блюдается на среде без добавления Сахаров, а *ый высокий — на среде не с глюкозой, как здовало ожидать, а на среде с мальтозой. Следу- цим неожиданным результатом было то, что при япературе 28 °С на среде, содержащей как маль- зу, так и глюкозу, не наблюдается существенного яетения выхода ИФН, которое имеет место при мпературе 37 ° С Это свидетельствует о том, что наруженное нами ингибирование синтеза ИФН в етках Е. coli SG30 (pIF-16) имеет температуро- висимый характер. В ходе дальнейших экспериментов исследовали ияние на уровень синтеза ИФН концентрации льтозы в питательной среде при культивирова­ нии клеток Е. coli SG30 (pIF-16) при температурах 37 и 28 °С. Анализ электрофореграммы образцов (рис. 4) показал, что уровень синтеза ИФН в клетках, культивируемых при температурах 37 (дорожка 1) и 28 °С (дорожка 2) на среде без мальтозы, сопоставим. Выход ИФН при выращива­ нии клеток Е. coli SG30 (pIF-Ш при температуре ОПш, нм 12 Р и с 3. Выход биомассы при выращивании продуцента при температуре 28 (а) и 37 °С (б) на средах LB без Сахаров (У, контроль); с глюкозой (0 ,4 % ) (2 ) ; мальтозой (0,4 %) (3) 167 file:///plF-16 СЛАВЧЕНКО И. Ю. Рис. 4. Электрофореграмма образцов клеток Е. coli SG30 (pIF- 16), выращенных при температуре 37 (7, 3 , 5 , 7, 9) или 28 °С (2, 4, 6, 5 , 10) на средах: 7 , 2 — LB; 3 , 4 — LB с мальтозой (ОД % ) ; 5 , 6 — LB с мальтозой (0,2 % ) ; 7, # — LB с мальтозой (0,3 % ) ; 9, 70 — LB с мальтозой (0,4 % ) . Положение ИФН указано стрелкой 37 °С на среде, содержащей мальтозу в концентра­ ции 0,1 (дорожка 3) и 0,2 % (дорожка 5 ) , незна­ чительно ниже, чем в контроле (дорожка / ) . При культивировании клеток при температуре 37 °С на среде, содержащей мальтозу в концентрации 0,3 (дорожка 7) и 0,4 % (дорожка 9 ) , синтез рекомби­ нантного белка резко угнетен. При выращивании же продуцента при 28 °С концентрация мальтозы на синтез целевого продукта существенно не влия­ ет (дорожки 4, 6, £ , 10) и приближается к контро­ лю (дорожка 2 ) . Близкие результаты получены нами и при исследовании влияния на выход ИФН различных концентраций глюкозы в питательной среде и тем­ пературы культивирования клеток Е. coli SG30 (pIF-16). Так, установлено, что при выращивании продуцента при температуре 28 °С выход целевого продукта в вариантах, содержащих глюкозу в пи­ тательной среде независимо от ее концентрации, сравним с таковым в контроле (рис. 5, а). При выращивании продуцента при температуре 37 °С в среде с концентрацией глюкозы 0,05 % уровень синтеза ИФН несколько ниже, чем в контроле, а при 0,1; 0,2; 0,3 и 0,4 % — резко угнетен (рис 5, б). Таким образом, при выращивании продуцента Е. coli SG30 (pIF-16) при температуре 37 °С максимальная концентрация глюкозы в питатель­ ной среде, при которой еще существенно не снижа­ ется выход ИНФ, составляет 0,05 %, а мальто­ зы — 0 , 2 %. Обнаруженная нами способность глюкозы и мальтозы негативно влиять на выход целевого про­ дукта проявляется подобно катаболитной репрес­ сии, имеющей место при регуляции лактозного и более чем 100 других оперонов [30] . Однако в нашем случае наблюдается аналогичный феномен при экспрессии генов ИНФ, находящихся под кон­ тролем искусственно сконструированного тандема триптофановых промоторов. Регуляция транскрип­ ции триптофанового оперона достаточно хорошо изучена и, как известно, триптофановый промотор нечувствителен к катаболитной репрессии. Уста­ новленная в ходе данных исследований зависи­ мость угнетения синтеза целевого продукта от кон­ центрации глюкозы и мальтозы в культуральной среде, проявляющаяся только при повышенной температуре, является очень интересным и неожи­ данным результатом сама по себе, а также в связи с тем, что экспрессия генов ИФН контролируется триптофановыми промоторами. В литературе нам не удалось найти подобных данных в случае био­ синтеза каких-либо белков в клетках Е. coli. Можно сделать предположение, что при добав­ лении в питательную среду глюкозы изменяется уровень синтеза бактериальных белков, которые тем или иным способом оказывают положительное или отрицательное влияние на какой-либо из эта­ пов экспрессии чужеродного продукта. Хотя угне­ тение синтеза ИФН наблюдается при добавлении в питательную среду двух разных Сахаров, возмож­ но, в случае использования как глюкозы, так и мальтозы имеет место один механизм репрессии, поскольку мальтоза является дисахаридом, расщеп­ ляющимся в результате ферментативного гидроли­ за с образованием двух молекул глюкозы. Изуче­ ние природы описанного в данной работе феномена может послужить предметом специальных исследо­ ваний, однако обнаруженные нами свойства куль­ туры Е. coli SG30 (pIF-16) позволят более целена­ правленно манипулировать данными параметрами при отработке технологического процесса получе­ ния ИФН с использованием фага лямбда. Таким образом, в результате исследований ус­ тановлено, что при выращивании клеток Е. coli SG30 (pIF-16) при температуре 37 °С в среде, содержащей в качестве источников углерода маль­ тозу или глюкозу, может существенно снижаться уровень синтеза ИФН по сравнению со средой без добавления этих Сахаров. Показано, что выход ИФН зависит от температуры культивирования продуцента и концентрации данных Сахаров в пи­ тательной среде. Глюкоза отрицательно влияет на синтез ИФН в более низких концентрациях, чем мальтоза. Установлено, что добавление мальтозы в культуральную среду обеспечивает более высокий выход биомассы, чем добавление глюкозы, при 168 ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ СИНТЕЗА АЛЬФА-2 ИНТЕРФЕРОНА } 2 3 4 5 $ М Ы I 2 3 4 5 6 Рис. 5. Электрофореграмма образцов клеток Е. coli SG30 ipIF-16), выра­ щенных при температурах 28 (а) и 37 °С (б) на средах: / — LB; 2 — LB с глюкозой (0 ,05 % ) ; 3 — LB с глю­ козой (0,1 % ) ; 4 — LB с глюкозой (0,2 % ) ; 5 — LB с глюкозой (0,3 % ) ; 6 - L B с глюкозой (0,4 % ) . Положение ИФН указано стрелкой выращивании клеток штамма-продуцента Е. coli SG30 (pIF-16) при температуре как 37, так и 28 °С. Автор выражает признательность И. П. Костю- ченко и Е. В. Борейко за постановку отдельных экспериментов, Е. Н. Пехоте — за денситометриро- вание гелей и определение молекулярной массы белков, В. Г. Коробко — за предоставление штамма Е. coli SG20050 ipIF-16). I. Yu. Slavchenko Investigation the influence of cultivation conditions on production of human alpha-2b interferon in Escherichia coli Summary The influence of glucose and maltose presence in a growth medium, as well as the temperature of producer cultivation on the production level of the human alpha-2b interferon (IFN) in E. coli have been studied. E. coli SG30 (pIF-16) harbouring plasmid pIF-16 bearing tandem of the artificial JFNs genes under the control of the trp promoters* tandem has been used as strain-producer of I FN. Results indicate that during E. coli SG30 (pIF-16) cells cultivation at 37 degrees С in the presence of maltose or glucose as carbone sourse in growth medium the yield of I FN was appreciably decreased in comparison with carbons — free medium We have also demon­ strated that the level of I FN production depends on the concen­ tration of these carbons in a medium and the cultivation tempe­ rature of producer. Glucose exerts negative influence on synthesis I FN in lower concentration, than maltose. It was shown this study, that the addition of maltose to the medium resulted higher yield of cells biomass, than the addition of glucose during growth E. coli SG30 (pIF-16) both 37, and 28 degrees C. І. Ю. Славченко Вивчення особливостей синтезу альфа-2Ь інтерферону людини в клітинах Escherichia coli при різних умовах культивування Резюме Досліджено вплив на рівень синтезу альфа-2Ь інтерферону (ІФН) людини в клітинах Е. coli SG30 (pIF-16) наявності у поживному середовищі глюкози і мальтози, а також темпера­ тури культивування продуцента. Продуцент ІФН містить плазміду pIF-16, яка несе тандем штучних генів ІФН. Кон­ ститутивну експресію цих генів забезпечує тандем трипто- фанових промоторів. У результаті досліджень виявлено, що при вирощуванні клітин Е. coli SG30 (pIF-16) при темпера­ турі 37 °С у середовищі, що містить як джерела вуглецю мальтозу або глюкозу, може суттєво знижуватися рівень виходу ІФН порівняно з середовищем без додавання цих цукрів. Показано, що вихід ІФН залежить від температури культиву­ вання продуцента та концентрації даних цукрів у поживному середовищі. Глюкоза виявляє негативний вплив на синтез ІФН у нижчих концентраціях, ніж мальтоза. Встановлено, що додавання мальтози до культурального середовища забезпечує більш високий вихід біомаси, ніж додавання глюкози, при вирощуванні клітин штама-продуцента Е. coli SG30 (pIF-16) як при температурі 37, так і 28 °С. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Машко С. В. Оптимизация экспрессии чужеродных генов в клетках Е. coli II Биотехнология.—1998.—№ 6.—С. 3 — 23. 2. Вапеух F. Recombinant protein expression in Escherichia coli II Curr. Opin. Biotechnol.—1999.—10, N 5 .—P. 411—421 . 3. Weickert M. J., Doherty D. H.t Best E. A., Olins P. O. Optimization of heterologous protein production in Escherichia coli II Curr. Opin. Biotechnol.—1996.—7, N 5 .—P. 494— 499. 4. Jacques N., Guillerez J., Dreyfus M. Culture conditions differentially affect the translation of individual Escherichia coli mRNAs / / J . Мої. Biol .—1992.—226, N 3 .—P. 597—608 . 5. Murby M., Uhlen M., Stahl S. Upstream strategies to minimize proteolytic degradation upon recombinant production in Es­ cherichia coli II Protein. Exp. Purif.—1996.—7, N 2 .— P. 129—136. 6. Winther-Larsen H. C, Josefsen K. D., Brautaset Т., Valla S. Parameters affecting gene expression from the Pm promoter in gram-negative bacteria / / Metab. Eng.—2000.—2, N 20 .— P. 79—91. 7. Heyde M., Laloi P., Portalier R. Involvement of carbon source and acetyl phosphate in the external-pH-dependent expression 169 СЛАВЧЕНКО И. Ю. of porin genes in Escherichia coli II J . Bacteriol.—-2000.— 182, N 1.—P. 198—202. 8. Chagneau C , Heyde M., Alonso S., Portalier R.f Laloi P. External-pH-dependent expression of the maltose regulon and ompf gene in Escherichia coli is affected by the level of glycerol kinase, encoded by glpK II J . Bacteriol.—2001.— 183, N 19.—P. 5 6 7 5 — 5 6 8 3 . 9. Tseng C. P., Yu С. C , Lin H. #., Chang C. Y., Kuo /. T. Oxygen- and growth rate-dependent regulation of Escherichia coli fumarase (FumA, FumB, and FumC) activity / / J . Bacteriol.—2001.—183, N 2 .—P. 461—467. 10. Too #., Bausch C , Richmond C , Blattner F. R., Conway T. Functional genomics: expression analysis of Escherichia coli growing on minimal and rich media / / J . Bacterid.—1999.— 181, N 20 .—P. 6425—6440 . ll.Ertl P., Unterladstaetter В., Bayer K, Mikkelsen S. R. Ferricyanide reduction by Escherichia coli: kinetics, mecha­ nism, and application to the optimization of recombinant fermentations / / Anal. Chem.—2000.—72, N 20 .—P. 4949— 4956. 12. Jeong К /., Lee S. Y. High-level production of human leptin by fed-batch cultivation of recombinant Escherichia coli and its purification / / Appl. Environ. Microbiol.—1999.—65, N 7.— P. 3027—3032. 13. Schmidt M.f Babu К R., Khanna N., Marten S., Rinas U. Temperature-induced production of recombinant human insulin in high-cell density cultures of recombinant Escherichia coli II J . Biotechnol.—1999.—68, N 1.—P. 71—83 . 14. Charpentier В., Bardey K, Robas N., Branlant C. The E U G , C protein is involved in glucose-mediated activation of Es­ cherichia coli gap A and gapB-pgk transcription / / J . Bac­ teriol.—1998.—180, N 24 .—P. 6476—6483 . 15. Li X., Taylor К B. Effect of glucose on the expression parameters of recombinant protein in Escherichia coli during batch growth in complex medium / / Biotechnol. Progr.— 1994.—10, N 2 .—P. 160—164. 16. Brautaset T.t Petersen S.t Valla S. An experimental study on carbon flow in Escherichia coli as a function of kinetic properties and expression levels of the enzyme phosphoglu- comutase / / Biotechnol. Bioeng.—1998.—58, N 2 — 3 . — P. 299—302. 17. Aristidou A. A., San К Y., Bennett G N. Improvement of biomass yield and recombinant gene expression in Escherichia coli by using fructose as the primary carbon source / / Biotechnol. Progr .—1999.—15, N 1.—P. 140—145. 18. Kagawa N.t Cao Q. Osmotic stress induced by carbohydrates enhances expression of foreign proteins in Escherichia coli II Arch. Biochem. and Biophys.—2001.—393, N 2.—P. 290— 296. 19. Barth S., Huhn A/., Matthey В., Klimka A.t Galinski E. A., Engert A. Compatible-solute-supported periplasmic expression of functional recombinant proteins under stress conditions / / Appl. Environ. Microbiol.—2000,—66, N 4 .—P. 1572—1579. 20. Blackwell /. R., Horgan R. A novel strategy for production of a highly expressed recombinant protein in an active form / / FEBS L e t t . - 1 9 9 1 . - 2 9 5 , N 1 - 3 . - P . 1 0 - 1 2 . 21. Славченко И. Ю. Исследование эффективности исполь­ зования бактериофага Я для получения а2 интерферона человека в клетках Escherichia coli: Автореф. дис. ... канд. биол. наук.—Киев, 1990 .—19 с. 22. Славченко И. Ю. Отбор чувствительных к бактериофагу А клонов из устойчивого к нему штамма Escherichia coli II Біополімери і клітина.—2001.—17, № 2,—С. 160—165. 23. Славченко Я . Ю. Экспрессия альфа-2b интерферона чело­ века в различных штаммах Escherichia coli II Біополімери і клітина.—2001.—17, № 6.—С. 546—550 . 24. Маниатис Т., Фрич Э.> Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.—M.: Мир, 1984.—479 с. 25. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assemb­ ly of the head of bacteriophage T4 / / Nature.—1970.—227.— P. 680—685. 26. А. с. СССР № 1092176. Способ получения искусственного гена интерферона а2 человека и способ получения поли­ пептида с активностью интерферона микробиологическим синтезом / M. Н. Колосов, В. Г. Коробко, В. Н. Добрынин, И. В. Северцова, С. А. Чувпило, Н. С. Быстрое, Ю. А. Берлин, А. Л. Каюшин, В. В. Буткус, И. А. Полякова, Е . Ф. Болдырева, Л. С. Сандахчиев, С. Г. Попов, Т. Н. Шубина, В. В. Кравченко, О. И. Серпинский, В. Ф. Ямщиков, С. И. Беликов, А. Н. Синяков, Г. Ф. Сиволобова / / Опубл. в БИ № 18, 1984. 27. Кравченко В. В., Гилева Я . Я . , Шамин В. В., Куличков В. А , Добрынин В. Н.у Филиппов С. А., Чувпило С. А , Коробко В. Г. Дупликация синтетического гена лейко­ цитарного интерферона человека и его экспрессия в соста­ ве полицистронных мРНК с сопряженной системой транс­ ляции / / Биоорг. химия.—1987.—13, № 9.—С. 1186— 1193. 28. Акименко 3. А , Зыков С. А., Шапров В. В., Офицеров В. Я. , Гилева И. П., Кравченко В. В., Сандахчиев Л. С. Химически синтезированный ген обеспечивает в клетках Escherichia coli биосинтез полипептида, структура которого соответствует лейкоцитарному интерферону а2 человека / / Докл. АН СССР.—1991 .—319 , № 5.—С. 1248—1251. 29. Schwartz М. The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity / / J . Мої. Biol .—1976.—103.— C. 521—536. 30. Kolb A , Busby S.t Вис H.> Gorges S.f Adhya S. Transcription­ al regulation by cAMP and its receptor protein / / Annu. Rev. Biochem.—1993.—62.—P. 749—795 . УДК 579.258 + 579.69 Надійшла до редакції 07.08.01 170 http://Lett.-1991.-295

Ähnliche Einträge