S-Форма ДНК – надсуперспіральна макромолекула з міжнуклеотидною відстанню ~2 Å уздовж осі дуплексу

За допомогою атомно-силової мікроскопії візуалізовано суперспіральну ДНК pGEMEX довжиною 3993 пари нуклеотидів, іммобілізовану на різних субстратах (свіжосколотій слюді, стандартній амінослюді і модифікованій амінослюді – з підвищеною та зниженою поверхневою щільністю аміногруп у порівнянні зі станд...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2005
Автори:	Лиманська, О.Ю., Лиманська, Л.О., Лиманський, О.П.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2005
Назва видання:	Біополімери і клітина
Теми:	Структура та функції біополімерів
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155875
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	S-Форма ДНК – надсуперспіральна макромолекула з міжнуклеотидною відстанню ~2 Å уздовж осі дуплексу / О.Ю. Лиманська, Л.О. Лиманська, О.П. Лиманський // Біополімери і клітина. — 2005. — Т. 21, № 6. — С. 515-524. — Бібліогр.: 29 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-155875
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1558752025-02-23T18:57:04Z S-Форма ДНК – надсуперспіральна макромолекула з міжнуклеотидною відстанню ~2 Å уздовж осі дуплексу S-Форма ДНК — сверхсуперспирализованная макромолекула с межнуклеотидным расстоянием ~2 А вдоль оси дуплекса S-DNA is oversupercoiled macromolecule with ~2 Å rise per nucleotide pair Лиманська, О.Ю. Лиманська, Л.О. Лиманський, О.П. Структура та функції біополімерів За допомогою атомно-силової мікроскопії візуалізовано суперспіральну ДНК pGEMEX довжиною 3993 пари нуклеотидів, іммобілізовану на різних субстратах (свіжосколотій слюді, стандартній амінослюді і модифікованій амінослюді – з підвищеною та зниженою поверхневою щільністю аміногруп у порівнянні зі стандартною). На модифікованій амінослюді з підвищеною щільністю заряду візуалізовано молекули ДНК з надзвичайно високим рівнем суперспіралізації. Вимірювання контурної довжини поодиноких надсуперспіральних молекул ДНК дозволило визначити відстань між парами нуклеотидів уздовж осі подвійної спіралі, яка варіювала від Н- 1,94 до 2,19 Å для різних молекул. Такі стиснуті подібно до пружини суперспіральні молекули ДНК зі зменшеною міжнуклеотидною відстанню порівняно з відомими формами ДНК віднесено до нової форми ДНК – S-ДНК. С использованием атомно-силовой микроскопии визуализирована суперспирализованная ДНК pGEMEX длиной 3993 пары нуклеотидов, иммобилизованная на различных субстратах (свежесколотой слюде, стандартной аминослюде и модифицированной аминослюде — с повышенной и пониженной поверхностной плотностью аминогрупп по сравнению со стандартной). На модифицированной аминослюде, характеризующейся повышенной поверхностной плотностью заряда, визуализиро ваны молекулы ДНК с чрезвычайно высоким уровнем суперспирализации. Измерение контурной длины единичных суперспирализованных молекул ДНК позволило определить расстояние между нуклеотидами вдоль оси двойной спирали, варьирующее от Н-1,94 до 2,19 Å для разных молекул Такие сжатые подобно пружине суперспиральные молекулы ДНК с уменьшенным межнуклеотидным расстоянием по сравнению с известными формами ДНК были отнесены к новой форме ДНК – S-ДНК. The supercoiled pGEMEX DNA with length of 3993 nucleotides was immobilized on different substrates (freshly cleaved mica, standard aminomica, modified aminomica with increased and decreased aminogroups surface density comparing with standard aminomica) and studied by the atomic force microscopy. The DNA molecules with extremely high level of supercoiling were visualized on the modified aminomica with increased surface charge density. The rise per nucleotide pair was determined by measurement of a contour length of single oversupercoiled DNA molecules. The rise value per nucleotide pair varied from H=1.94 Å up to H=2.19 Å for different molecules. These spring-like compressed supercoiled DNA molecules with decreased rise in comparison with well known DNA forms were referred to the new DNA form, called S-DNA. Роботу виконано за часткової підтримки Японського товариства розвитку науки (Токіо). Автори висловлюють щиру подяку д-ру А. Сиволобу (Київський Національний університет імені Тараса Шевченка) за критичні зауваж 2005 Article S-Форма ДНК – надсуперспіральна макромолекула з міжнуклеотидною відстанню ~2 Å уздовж осі дуплексу / О.Ю. Лиманська, Л.О. Лиманська, О.П. Лиманський // Біополімери і клітина. — 2005. — Т. 21, № 6. — С. 515-524. — Бібліогр.: 29 назв. — укр. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00070F https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155875 577.2:577.32 uk Біополімери і клітина application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Структура та функції біополімерів Структура та функції біополімерів
spellingShingle	Структура та функції біополімерів Структура та функції біополімерів Лиманська, О.Ю. Лиманська, Л.О. Лиманський, О.П. S-Форма ДНК – надсуперспіральна макромолекула з міжнуклеотидною відстанню ~2 Å уздовж осі дуплексу Біополімери і клітина
description	За допомогою атомно-силової мікроскопії візуалізовано суперспіральну ДНК pGEMEX довжиною 3993 пари нуклеотидів, іммобілізовану на різних субстратах (свіжосколотій слюді, стандартній амінослюді і модифікованій амінослюді – з підвищеною та зниженою поверхневою щільністю аміногруп у порівнянні зі стандартною). На модифікованій амінослюді з підвищеною щільністю заряду візуалізовано молекули ДНК з надзвичайно високим рівнем суперспіралізації. Вимірювання контурної довжини поодиноких надсуперспіральних молекул ДНК дозволило визначити відстань між парами нуклеотидів уздовж осі подвійної спіралі, яка варіювала від Н- 1,94 до 2,19 Å для різних молекул. Такі стиснуті подібно до пружини суперспіральні молекули ДНК зі зменшеною міжнуклеотидною відстанню порівняно з відомими формами ДНК віднесено до нової форми ДНК – S-ДНК.
format	Article
author	Лиманська, О.Ю. Лиманська, Л.О. Лиманський, О.П.
author_facet	Лиманська, О.Ю. Лиманська, Л.О. Лиманський, О.П.
author_sort	Лиманська, О.Ю.
title	S-Форма ДНК – надсуперспіральна макромолекула з міжнуклеотидною відстанню ~2 Å уздовж осі дуплексу
title_short	S-Форма ДНК – надсуперспіральна макромолекула з міжнуклеотидною відстанню ~2 Å уздовж осі дуплексу
title_full	S-Форма ДНК – надсуперспіральна макромолекула з міжнуклеотидною відстанню ~2 Å уздовж осі дуплексу
title_fullStr	S-Форма ДНК – надсуперспіральна макромолекула з міжнуклеотидною відстанню ~2 Å уздовж осі дуплексу
title_full_unstemmed	S-Форма ДНК – надсуперспіральна макромолекула з міжнуклеотидною відстанню ~2 Å уздовж осі дуплексу
title_sort	s-форма днк – надсуперспіральна макромолекула з міжнуклеотидною відстанню ~2 å уздовж осі дуплексу
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	2005
topic_facet	Структура та функції біополімерів
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/155875
citation_txt	S-Форма ДНК – надсуперспіральна макромолекула з міжнуклеотидною відстанню ~2 Å уздовж осі дуплексу / О.Ю. Лиманська, Л.О. Лиманська, О.П. Лиманський // Біополімери і клітина. — 2005. — Т. 21, № 6. — С. 515-524. — Бібліогр.: 29 назв. — укр.
series	Біополімери і клітина
work_keys_str_mv	AT limansʹkaoû sformadnknadsuperspíralʹnamakromolekulazmížnukleotidnoûvídstannû2auzdovžosídupleksu AT limansʹkalo sformadnknadsuperspíralʹnamakromolekulazmížnukleotidnoûvídstannû2auzdovžosídupleksu AT limansʹkijop sformadnknadsuperspíralʹnamakromolekulazmížnukleotidnoûvídstannû2auzdovžosídupleksu AT limansʹkaoû sformadnksverhsuperspiralizovannaâmakromolekulasmežnukleotidnymrasstoâniem2avdolʹosidupleksa AT limansʹkalo sformadnksverhsuperspiralizovannaâmakromolekulasmežnukleotidnymrasstoâniem2avdolʹosidupleksa AT limansʹkijop sformadnksverhsuperspiralizovannaâmakromolekulasmežnukleotidnymrasstoâniem2avdolʹosidupleksa AT limansʹkaoû sdnaisoversupercoiledmacromoleculewith2arisepernucleotidepair AT limansʹkalo sdnaisoversupercoiledmacromoleculewith2arisepernucleotidepair AT limansʹkijop sdnaisoversupercoiledmacromoleculewith2arisepernucleotidepair
first_indexed	2025-11-24T12:56:35Z
last_indexed	2025-11-24T12:56:35Z
_version_	1849676524951699456
fulltext	ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2005. Т. 21. № 6 СТРУКТУРА І ФУНКЦІЇ БІОПОЛІМЕРІВ S-Форма ДНК — надсуперспіральна макромолекула з міжнуклеотидною відстанню ~2 А уздовж осі дуплексу О. Ю. Лиманська1' 2, Л. О. Лиманська1, О. П. Лиманський1' 3 'інститут мікробіології і імунології ім. Мечникова АМН України Вул. Пушкінська, 14, Харків, 61057, Україна 2 Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН Вул. Пушкінська, 83, Харків, 61023 З Лабораторія плазматичної мембрани і ядерного сигнального механізму, Інститут біодосліджень Кіотський університет, Кіото, 606-8502, Японія E-mail: o.lymunskiy@mail.ru За допомогою атомно-силової мікроскопії візуалізовано суперспіральну ДНК pGEMEX довжиною 3993 пари нуклеотидів, іммобілізовану на різних субстратах (свіжосколотій слюді, стандартній амінослюді і модифікованій амінослюді — з підвищеною та зниженою поверхневою щільністю аміногруп у порівнянні зі стандартною). На модифікованій амінослюді з підвищеною щільністю заряду візуалізовано молекули ДНК з надзвичайно високим рівнем суперспіралізації. Вимірювання контурної довжини поодиноких надсуперспіральних молекул ДНК дозволило визначити відстань між парами нуклеотидів уздовж осі подвійної спіралі, яка варіювала від Н- 1,94 до 2,19 А для різних молекул. Такі стиснуті подібно до пружини суперспіральні молекули ДНК зі зменшеною міжнуклеотидною відстанню порівняно з відомими формами ДНК віднесено до нової форми ДНК — S-ДНК. Ключові слова: суперспіральна ДНК, атомно-силова мікроскопія, амінослюда, надсуперспіральна ДНК, S-ДНК. Вступ. Структурні та фізико-хімічні параметри різних родин і форм молекул Д Н К — А-, В-, С-, D- , Z-, Н - Д Н К — є загальновідомими даними, встановленими на основі фізичних, біофізичних, біохімічних і молекулярно-генетичних методів [ 1 — 3 ] . Одними з основних критеріїв, що дозволяють диференціювати найвивченіші і найпоширеніші А- і В-форми Д Н К , є конформація дезоксирибози (СЗ'-ендо — для А-форми Д Н К і С2'-ендо — для В-форми), а також відстань між парами нуклео тидів уздовж осі дуплексу. Вважають, що відстань між парами нуклеотидів уздовж осі подвійної спіра лі залежить від різних факторів (вологість, іонні © о. Ю ЛИМАНСЬКА, л. О. ЛИМАНСЬКА, О. П. ЛИМАНСЬКИЙ, 2005 умови та ін.) і варіює від 0,34—0,30 нм для В-форми Д Н К до 0,33—0,25 нм для А-форми [2 ]. Починаючи з 90-х років минулого століття, бурхливий розвиток нанобіології, пов'язаний з ви никненням сканувальної зондової мікроскопії, дав новий поштовх дослідженню структурних особли востей молекул Д Н К [4, 5 ] . За допомогою атомно- силової мікроскопії (АСМ) стали можливими як візуалізація поодиноких молекул ДНК, так і вимі рювання сили внутрішньомолекулярних зв 'язків ниток Д Н К і сили міжмолекулярної взаємодії у комплексі ДНК—білок (шляхом визначення сили розриву в режимі силових вимірювань) [6, 7 ] . Однак при в ізуалізаці ї суперспіральних Д Н К (ссДНК) і нуклеосом не вдалося досягти найвищого 515 mailto:o.lymunskiy@mail.ru ЛИМАНСЬКА О. Ю., ЛИМАНСЬКА Л. О., ЛИМАРСЬКИЙ О. П. рівня компактизації, характерного як для ДНК у ядрах еукаріотних клітин, так і ДНК бактері альних клітин. Це пов'язано з тим фактом, що в переважній більшості досліджень з візуалізації ссДНК in vitro за допомогою АСМ ступінь нейт ралізації зарядів фосфатних груп ДНК визначали в доволі вузькому діапазоні, змінюючи іонну силу розчину [8—10]. Хоча відомо, що основним фактором, який спричинює компактизацію ДНК, є ступінь нейт ралізації заряду негативно заряджених фосфатних груп ДНК, зміна іонної сили розчину при варі юванні концентрації NaCl або полікатіону на по верхні слюди, що використовують для іммобілізації ДНК, призводила до незначної суперспіралізації ДНК (значення суперспіральної щільності зміню валося в інтервалі 0,03 < ІаІ < 0,08) [11, 12]. У цій роботі ми вперше демонструємо зобра ження поодиноких молекул ссДНК in vitro, рівень суперспіралізації яких значно перевищує такий як раніше експериментально визначений [9—13], так і передбачений теоретично [14—17]. За допомогою вимірювання контурної довжини суперспіральних молекул ДНК із АСМ зображень визначено від стань між парами нуклеотидів уздовж осі подвійної спіралі надсуперспіральних молекул. Такі супер- спіральні молекули ДНК, що характеризуються значенням міжнуклеотидної відстані Я = 1 , 9 4 — 2,19 А, віднесені нами до нової форми ДНК — так званої S-ДНК (S — від англійського «spring» — пружина). Дійсно, суперспіральні молекули ДНК на поверхні слюди подібні до пружини — вони можуть як стискатися зі зменшенням міжнуклео тидної відстані, так і розтягуватися (в даній роботі нами також отримано зображення витягнених мо лекул ссДНК з міжнуклеотидною відстанню 4,5— 5,5 А). Матеріали і методи. У роботі використано ссДНК pGEMEXl довжиною 3993 п. н. («Рго- mega», США). Свіжосколоту слюду, стандартну і модифіковану амінослюду зі зниженою та під вищеною поверхневою щільністю аміногруп порів няно зі стандартною амінослюдою застосовували як субстрат. Для нанесення ДНК на свіжосколоту слюду використовували 10 мМ HEPES-буфер, який містить 2,5 мМ MgCl 2. На смугу стандартної або модифікованої амінослюди площею 1 см 2 наносили краплю розчину Д Н К в концентрації 0,1 — 1 мкг/мл у ТЕ-буфері (10 мМ трис-НСІ, рН 7,9, 1 мМ ЕДТА) об'ємом 10 мкл, промивали після 2-хв експозиції деіонізованою водою, обдували потоком аргону та витримували зразок під тиском 100 мм рт. ст. протягом 20 хв. Процедуру отримання стан дартної амінослюди здійснювали згідно з [18] за допомогою модифікації свіжосколотої слюди аміно групами у парах перегнаного 3-амінопропілтри- етоксисилану (АПТЕС) («АМгісп», США). Дисти ляцію АПТЕС здійснювали за зменшеного тиску в атмосфері аргону. Для аміномодифікації свіжоско лоту слюду вміщували в скляний ексикатор з розчинами АПТЕС та Н,И-діізопропілетиламіну на 1 год. Модифіковану слюду зберігали в ексикаторі в атмосфері аргону протягом одного місяця. Буферні розчини і зразки ДНК готували з використанням ультрачистої води з питомим опо ром - 17 М О м с м та установки Milli Q («МШіроге», США). Модифіковану амінослюду отримано за до помогою невеликих змін технології одержання стандартної амінослюди. Амінослюду зі зменшеною поверхневою щільністю аміногруп, як і стандартну амінослюду, отримували обробкою свіжосколотої слюди в парах неперегнаного АПТЕС. У роботі використано АСМ Nanoscope IV Multi- Mode System (Veeco Instruments Inc., США) з Е-сканером. ACM зображення ДНК записано за допомогою вібруючого варіанта АСМ у повітрі в режимі «висота» з використанням OMCL-AC160TS кантиліверів (Olympus Optical Co., Японія) з резо нансною частотою 340—360 кГц і константою твер дості 42 Н/м . Зображення отримано у форматі 512 х 512 пікселів, згладжено та проаналізовано за допомогою програмного забезпечення Nanoscope (версія 5.12r3) (Veeco Instruments Inc., США). Об'єм окремих молекул ДНК розраховували на основі реально виміряних параметрів молекул із АСМ зображення — висоти, довжини і ширини, без поправки на уширення діаметра ДНК. Для точ нішого вимірювання об'єму молекул використову вали побудову, як правило, поздовжніх і попереч них перерізів молекул за допомогою вбудованої опції програмного забезпечення Nanoscope. Результати і обговорення. У даній роботі від станню між основами (R) ми називаємо відстань між площинами основ, а відстанню між нуклеоти- дами вздовж осі спіралі (Я) , або райзом (від англійського слова rise), — проекцію відстані між основами на вісь подвійної спіралі ДНК. Для В- форми ДНК площини основ майже перпендику лярні осі дуплексу, тому значення міжнуклеотид ної відстані та відстані між основами дуже близькі 516 S-ФОРМА ДНК - НАДСУПЕРСПІРАЛЬНА МАКРОМОЛЕКУЛА Таблиця 1 Деякі характеристики трьох форм ДНК Параметр А-ДНК В-ДНК S-ДНК Міжнуклеотидна відстань уздовж осі спіралі, А Кут нахилу основи, град Відстань між основами, А 2,56—3,29 3,03—3,37 1,94—2,19 20,2—10 16,4—5,9 30,5—27 2,72—3,34 3,16—3,39 2,25—2,45 за значенням (табл. 1). Значення R знайдено із співвідношення Н = Rcosa, де а — кут, що утворюють перпендикуляр до пло щини основи та вісь подвійної спіралі. Наведені у табл. 1 значення міжнуклеотидної відстані R, від стані між парами нуклеотидів Н для А-, В- [2] і S-ДНК демонструють суттєві відмінності в струк турній організації зазначених форм ДНК. Поверхня слюди, стандартного субстрату для іммобілізації біомолекул при АСМ дослідженнях, негативно заряджена у буферних розчинах за ней тральних значень рН та невисокої іонної сили [19]. Тому для іммобілізації на поверхні слюди за даних умов негативно заряджених молекул ДНК викори стовують декілька підходів, що дозволяють змінити сумарний поверхневий заряд слюди з негативного на позитивний. Найпростіше це можна зробити, якщо нанести краплю розчину ДНК, що містить іони Mg 2 + або Ni 2 + , на поверхню свіжосколотої слюди [20]. Альтернативні методи припускають модифікацію поверхні слюди різними полікатіо- нами — полілізином, сперміном, спермідином [9, 11, 12]. Але всі ці підходи мають істотний не долік — іммобілізацію ДНК на слюду можна про водити в дуже вузькому інтервалі значень рН та іонної сили, що виключає можливість значної змі ни поверхневої щільності заряду слюди. Розроблену нами раніше методику аміномо- дифікації АСМ зондів у парах АПТЕС [21 ] було модифіковано і використано для отримання аміно- слюди із заданими властивостями. В результаті модифікації стандартної процедури отримання амі- нослюди (поверхня якої має позитивний заряд у широкому інтервалі значень рН та іонної сили розчину) в даній роботі застосовано амінослюду як з підвищеним значенням поверхневої щільності заряду, так і зі зниженим порівняно з щільністю заряду стандартної амінослюди. Далі під модифіко ваною амінослюдою ми будемо розуміти аміно слюду з підвищеною поверхневою щільністю заря ду, якщо не вказано інше. Наведені на рис. 1 АСМ зображення ссДНК pGEMEX показують величезний вплив поверхне вих властивостей амінослюди на конформацію мо лекул. Молекули ДНК, іммобілізовані на стан дартній амінослюді (рис. 1, а), перебувають у наближеній до плектономічної конформації, у той час як підвищення поверхневої щільності заряду веде до вражаючої компактизації молекул ДНК (рис. 1 , 6 ) . Дуже важливим для оцінки властиво стей поверхні модифікованої слюди видається той факт, що зображення і кількість молекул ДНК на модифікованій амінослюді після її зберігання про тягом двох тижнів (рис. 1, б) подібні до таких на свіжовиготовленій стандартній амінослюді (рис. 1, а). Це означає, що, по-перше, кількість активних (тобто протонованих) аміногруп на поверхні мо дифікованої амінослюди значно перевищує таку на поверхні стандартної амінослюди і, по-друге, їхня стійкість до окислення значно вище стійкості амі ногруп стандартної амінослюди. Раніше нами показано, що кількість активних аміногруп на поверхні стандартної амінослюди іс тотно зменшується після двох тижнів зберігання, а період напівжиття стандартної амінослюди було оцінено саме в два тижні. Таким чином, мо дифікована амінослюда за своєю стабільністю і поверхневою щільністю аміногруп суттєво переви щує стандартну амінослюду. Саме завдяки цим відмінностям іммобілізація ссДНК на модифіко вану амінослюду дозволила нам отримати зобра ження поодиноких молекул ДНК з таким надзви чайно високим рівнем суперспіралізації, який рані ше не було виявлено ні експериментально, ні навіть передбачено теоретично. Наведені кадри до волі великого розміру ( 2 x 2 мкм) демонструють, що поверхня амінослюди містить лише молекули ДНК, вона вільна від забруднень і домішкових наночасток, які супроводжують деякі АСМ до слідження. Для характеристики топології ссДНК (моле кул, вісь яких може бути закручена у вигляді спіралі, на відміну від лінійних молекул ДНЮ прийнято використовувати декілька параметрів — кількість вузлів (супервитків), довжину суперспі- ральної осі, суперспіральну щільність. Останню можна визначити як відношення кількості супер- 517 ЛИМАНСЬКА О. Ю., ЛИМАНСЬКА Л. О., ЛИМАНСЬКИЙ О. П. витків до кількості витків подвійної спіралі, що знаходиться у релаксованому стані [22 ]. Зображен ня молекул ДНК, отримані з вищою роздільною здатністю і показані на рис. 2, засвідчують вели чезні відмінності в топології молекул ДНК, ім мобілізованих на свіжосколотій слюді із буфера, який містить 2,5 мМ MgCl 2 (рис. 2, а ) , стандартній амінослюді (рис. 2, б) та модифікованій амінослюді (рис. 2, є) . На рис. 2, а, представлено зображення плектономічних ссДНК, які характеризуються не високим значенням суперспіральної щільності (сім суперспіральних витків, або вузлів, ст = -0 ,018) . Раніше аналогічні зображення отримано для плаз- мідних ДНК на субстратах, оброблених поліка- тіонами полілізином і сперміном [11, 12]. Су- перспіральні молекули Д Н К pGEMEX на стан дартній амінослюді (б) компактизованіші, однак їхня контурна довжина, виміряна із АСМ зобра ження, лише незначно менша ( L = 1216 нм) по рівняно з такою плектономічних молекул ДНК на слюді з катіонами Mg 2 + ( L = 1243 нм, рис. 2, а). Для молекул Д Н К , зображених на рис. 2, а, кількість вузлів становить 7—8, довжина супер спіральної осі — 1 = 466 нм. Молекула ссДНК на рис. 2, в, іммобілізована на модифікованій амінослюді, різко відрізняється за своїми параметрами від молекул Д Н К , зображе них на рис. 2, а, б: кількість вузлів зросла до 11, довжина суперспіральної осі зменшилася до 382 нм, а розрахована із АСМ зображення контурна довжи на склала 873 нм. Вимірювання контурної довжини одиничної на- тивної молекули Д Н К з субнанометровою роз дільною здатністю, що є відмітною особливістю АСМ, дозволяє, знаючи кількість пар нуклеотидів в даній молекулі, визначити відстань між нуклео- тидами вздовж осі подвійної спіралі ДНК. Якщо для ДНК pGEMEX (рис. 2, а) міжнуклеотидна відстань Н= 3,11 А, то для надсуперспіральної ДНК (рис. 2, в) розраховане значення Н склало 2,19 А. Значення Н = 3,11 А узгоджується з раніше наведеними фактами незначного зменшення кон турної довжини Д Н К , висушеної на слюді, у при пущенні В-форми Д Н К [23]. Однак величина Н = = 2,19 А вказує на те, що суперспіральні молекули ДНК, іммобілізовані на амінослюді з підвищеною щільністю заряду, зазнають значних внутрішньо- молекулярних перетворень, які ведуть не лише до збільшення рівня суперспіралізації, але й до іс тотного зменшення міжнуклеотидної відстані. Рис. 1. Зображення суперспіральної ДНК (ссДНК) pGEMEX (3993 п. н.), отримане за допомогою АСМ після нанесення розчину ДНК у ТЕ-буфері на поверхню стандартної (а) і модифікованої (б) амінослюди з вищою поверхневою щільністю аміногруп (тобто підвищеною щільністю заряду) порівняно зі стандартною. Представлено ссДНК з різним рівнем компакти зації: від плектономічних (а, в) до суперспіральних молекул (б) з різною довжиною суперспіральної осі. Розмір кадру: а, в — 2 * х 2 мкм; б — 2,7 * 2,7 мкм; а, б — свіжовиготовлена слюда; в — модифікована (після 2 тижнів зберігання). Стрілка вказує на ссДНК, АСМ зображення якої з більшою роздільною здат ністю наведено на рис. З, б 518 S-ФОРМА ДНК - НАДСУПЕРСПІРАЛЬНА МАКРОМОЛЕКУЛА Рис. 2. АСМ зображення поодиноких суперспіральних молекул ДНК pGEMEX, іммобілізованих на різних субстратах: свіжо- сколотій слюді (а), отримане після нанесення краплі розчину ДНК у 10 мМ HEPES-буфері, який містить 2,5 мМ MgCl2; стандартній амінослюді (б) та модифікованій амінослюді (в). Розмір кадру: а — 583 и 583 нм; б, в — 500 х 500 нм. Контурна довжина ДНК pGEMEX становить 1243 нм (а); 1216 нм (б); 873 нм (в); довжина суперспіральної осі молекул ДНК — 466 нм (а) і 382 нм (е) На рис. З наведено інші АСМ зображення поодиноких надсуперспіральних молекул ДНК pGEMEX на модифікованій амінослюді. Розрахо вані значення міжнуклеотидної відстані складають Я = 1,94 і 2,11 А для надсуперспіральних молекул ДНК на рис. З, а і б відповідно. Як один із параметрів, що дозволяє відрізнити поодиноку молекулу від димеру та інших високо- компактизованих структур, утворених декількома молекулами, ми вибрали об'єм молекули Д Н К , розрахований безпосередньо із АСМ зображення відповідної молекули. Його значення незначно різ ниться від теоретично розрахованого виключеного об'єму молекули ( У в и к л = 3900 нм 3 ) та дозволяє надійно виокремити поодинокі молекули ДНК се ред агрегатів. Для точнішого обчислення об'єму ми використали значення висоти молекули, виміряне не в одному місці (яке значно варіює для надсу- перспіралізованих ДНК: за характерної висоти од нієї нитки подвійної спіралі h = 0,3—0,4 нм висота у вузлах, утворених двома нитками ДНК, що перетинаються, може досягати й т а х = 1,3—1,8 нм) , а по лінії поздовжнього перерізу молекули площи ною, перпендикулярною площині слюди. Фрагмент перерізу по висоті надсуперспіралі- зованої молекули Д Н К , а також відповідне АСМ зображення і лінія, через яку проведено січну площину, показано на рис. 4. Сумарну площу перерізу для даної молекули визначено як суму площин трьох перерізів по висоті (два інших пе рерізи не показано). І хоча в такому вимірюванні площі перерізу іммобілізованої суперспіральної мо лекули ДНК присутня систематична похибка, по в'язана з тим, що січну площину проводили лише при максимальному значенні висоти вздовж поз довжньої осі молекули, обчислені відповідним чи ном значення об'єму для вищенаведених ссДНК узгоджуються з теоретичним значенням виключе ного об'єму ДНК pGEMEX з достатньо високою точністю. Із наведених в табл. 2 характеристик молекул ссДНК можна бачити, що значення об'єму для надсуперспіралізованих молекул ДНК (№ 3—5 в табл. 2, рис. 2, в і рис. 3) збігається з таким для одиничної суперспіральної молекули (№ 1 в табл. 2, рис. 2, а) в межах похибки вимірювання. Теоретичне значення діаметра подвійної спі ралі ДНК (2 нм) значно відрізняється від експери ментально вимірюваних значень висоти (0 ,3— 0,4 нм) і ширини молекули (7—10 нм), що обу мовлено низкою причин. Вважають, що в разі вимірювання ширини нитки ДНК ефект уширення діаметра ДНК спричинений значним радіусом за округлення зонда (5—10 нм) і недостатньою фік сацією молекул Д Н К на платівці. Однак збіг зна чень теоретично розрахованого виключеного об'єму ДНК pGEMEX та значень об'єму молекули Д Н К , 519 ЛИМАНСЬКА О. Ю., ЛИМАНСЬКА Л. О., ЛИМАНСЬКИЙ О. П. Рис. 3. АСМ зображення суперспіральних молекул ДНК pGE MEX на модифікованій амінослюді: а — контурна довжина молекули ДНК становить L - 776 нм, що відповідає відстані між парами нуклеотидів уздовж осі подвійної спіралі / / = 1 , 9 4 А; б — контурна довжина молекули ДНК L • 852 нм; міжнук- леотидна відстань уздовж осі дуплексу Н -2 ,11 А. Розмір кадру для обох зображень 500 х 500 нм визначених із АСМ зображень (табл. 2) , показує, що розширення діаметра Д Н К при іммобілізації на слюді зумовлене не технічними похибками ви мірювання. Ефект розширення молекул Д Н К виз начений зміною під впливом поверхневих власти востей слюди їхньої конформації, що супровод жується значним зменшенням їхньої висоти, але в той же час збереженням об'єму. Ми хотіли б особливо звернути увагу на цю обставину, оскільки у переважній більшості робіт з АСМ візуалізації Рис. 4. Поздовжній переріз (а) та АСМ зображення (б) від повідної суперспіральної молекули ДНК pGEMEX. Січну пло щину проведено перпендикулярно площині рисунка через наве дену лінію. Об'єм молекули розраховано як добуток ширини молекули на суму площ трьох поздовжніх перерізів. Шість піків на перерізі відповідають шести вузлам, які чітко видно на рис. 4, б ДНК [4, 23] суттєве значення ширини молекул ДНК пояснювали саме похибкою вимірювання ато мно-силового мікроскопа, а також недостатньою фіксацією біомолекул. Таким чином, запропонова не нами пояснення ефекту «розширення діаметра» ДНК при АСМ вимірюваннях усуває існуюче про тиріччя між високим субнанометровим розділенням АСМ по Z-координаті та похибкою латерального вимірювання діаметра Д Н К . Раніше встановлено, що міжнуклеотидна від стань для дволанцюгової Д Н К пов'язана лінійною залежністю з кутом нахилу основ до осі спіралі [2 ]. На рис. 5 наведено графік, апроксимований до значення міжнуклеотидної відстані Я = 1,9 А. Ви значений із графіка модуль кута нахилу основ в S-ДНК у знаходиться в інтервалі 27° <у < 30,5°, що відповідає діапазону міжнуклеотидної відстані S- ДНК 1,94 А < Я < 2 , 1 9 А. 520 S-ФОРМА ДНК - НАДСУПЕРСПІРАЛЬНА МАКРОМОЛЕКУЛА Двониткова ДНК; "зображення ДНК отримано на слюді в буфері, амінослюді. Хоча при переході від А- до В-форми ДНК зі збільшенням міжнуклеотидної відстані у змінює знак з позитивного на негативний, стосовно кута нахилу у для S-ДНК ми не маємо достатньо даних про його знак. З урахуванням відомих експериментальних да них про еластичність молекул ДНК [24, 25] нами отримано зображення розтягнених ссДНК pGE MEX, наведених на рис. 6. Раніше відпрацьовано методику отримання розтягнених молекул ДНК фага Я при розташуванні краплі розчину ДНК на поверхні амінослюди зі зменшеною поверхневою щільністю заряду [26 ]. Розтягнені молекули ДНК формуються у процесі приготування зразка для АСМ та промивання слюди ультрачистою водою після експозиції з розчином ДНК. Збільшення кон турної довжини розтягнених ссДНК pGEMEX від 1243 нм (рис. 2, а) до 1943 нм (рис. 6, а) та 2140 нм (рис. 6, б) означає, що розтягування що містить M g C l 2 ; **зображення ДНК отримано на стандартній ссДНК у 1,56 і 1,72 разу веде до зростання міжнук леотидної відстані до Н = 4,87 і 5,36 А відповідно. Отримані дані для розтягнених молекул ДНК pGE MEX добре узгоджуються з раніше опублікованими результатами дослідження розтягнених ДНК різ ними методами, у тому числі і за допомогою методу оптичного пінцета [23 ]. Наприклад, у ро боті Мазур та ін. [25] продемонстровано, що ДНК можна розтягти, подовжуючи її в 1,7 разу. Це відповідає зростанню міжнуклеотидної відстані до Я = 5,8 А. На рис. 7 представлено побудовані нами моделі фрагмента молекули ДНК довжиною 15 п. н., що перебуває в А- (а) та S-формі (б) відповідно. Зазначені моделі неповністю відображають особли вості молекул ДНК, оскільки кут нахилу (у = 0) основ як для моделі S-ДНК, так і А-ДНК не відповідає розрахованим значенням (табл. 1). Не зважаючи на це, слід відзначити, що модель S- 521 ЛИМАНСЬКА О. Ю., ЛИМАНСЬКА Л. О., ЛИМАНСЬКИЙ О. П Рис. 5. Залежність кута нахилу основ від відстані між парами нуклеотидів уздовж осі подвійної спіралі. Кут нахилу основи визначено як кут між нормаллю до площини основи та віссю дуплексу ДНК наочно демонструє відсутність стеричних пе решкод для функціональних груп нуклеотидів та показує принципову можливість існування ДНК у такій стиснутій конформації. Розглянемо можливий механізм надсуперспіра- лізації ссДНК. При переході від візуалізації ДНК на свіжосколотій слюді до її візуалізації на стан дартній амінослюді (рис. 2, а) можна бачити, що молекули ДНК pGEMEX більш компактизовані, менш розтягнені, а поодинокі молекули розташо вані на меншій площі. Це можна пояснити силь нішим екрануванням негативно заряджених фос фатних груп Д Н К аміногрупами слюди, що веде до зменшення електростатичного відштовхування су сідніх фрагментів Д Н К . У даній роботі ми не досліджували адгезивних властивостей використаних субстратів. Відзначимо лише, що поверхневі властивості слюди можуть бути охарактеризовані із силового графіка (залеж ності сили розриву від відстані між зондом і суб стратом), отриманого за допомогою АСМ у режимі силових вимірювань. Раніше нами показано, що стандартна амінослюда, одержана внаслідок мо дифікації у парах АПТЕС, у водних розчинах за нейтральних значень рН характеризується сума рним позитивним зарядом і величиною сили адгезії F ~0,8—4,2 нН [27 ]. Однак на стандартній аміно слюді візуалізовані лише плектономічні ссДНК. І тільки на модифікованій амінослюді, яка характе ризується вищою поверхневою щільністю заряду (за нашими попередніми результатами, щільність аміногруп на модифікованій амінослюді в 2—3 рази вище порівняно із щільністю на стандартній амінослюді), стала можливою візуалізація поодино- Рис. 6. АСМ зображення розтягнених суперспіральних молекул ДНК pGEMEX, іммобілізованих на амінослюді зі зменшеною щільністю аміногруп: а — контурна довжина ДНК L ~ 1943 нм, що відповідає відстані між нуклеотидами вздовж осі подвійної спіралі Я - 4,87 А (розмір кадру 1,13 « 1,13 мкм); б — контурна довжина ДНК /, = 2140 нм, Н = 5,36 А (розмір кадру 1,07 х х 1,07 мкм) ких надсуперспіральних молекул Д Н К . У даному разі молекули біополімеру з високим значенням щільності заряду (ДНЮ поміщено на субстрат, який характеризується високою поверхневою щіль ністю позитивного заряду. При цьому через вищу 522 S-ФОРМА ДНК — НАДСУПЕРСПІРАЛЬНА МАКРОМОЛЕКУЛА щільність позитивно заряджених аміногруп на по верхні модифікованої амінослюди відбувається ек ранування більшої кількості негативних фосфатних груп ДНК. Крім того, на нашу думку, існує ще один (внутрішньомолекулярний) механізм компак- тизації Д Н К , який може робити істотний внесок за умов нейтралізації заряду фосфатних груп. У ро боті [28] теоретичними розрахунками показано, що нуклеотиди вздовж ланцюга Д Н К , які утворю ють сайти для інтеркаляції лігандів, неоднаково заряджені. Так , наприклад, ТА-сайт є найбільш електронегативним через те, що 2'-дезоксирибо-5'- монофосфат, приєднаний до аденіну (який має найбільший позитивний заряд серед азотистих ос нов) , є найбільш електронегативним. Це означає, що надсуперспіралізація Д Н К може бути обумовле на внутрішньомолекулярним електростатичним притяганням між різнорідно зарядженими нуклео- тидами Д Н К в умовах підвищеного екранування заряду фосфатних груп Д Н К . Результати даної роботи є експериментальним підтвердженням пророчих слів проф. М. Франк-Ка- менецького про те, що ступінь суперспіралізації Д Н К у клітині може бути значно вищою, ніж це уявлялося раніше [29] . Роботу виконано за часткової підтримки Япон ського товариства розвитку науки (Токіо). Автори висловлюють щиру подяку д-ру А. Сиволобу (Київ ський Національний університет імені Тараса Шев ченка) за критичні зауваження і дискусії при підготовці статті до друку. О. Yu. Limanskaya, L. A. Limanskaya, A. P. Limanskii S-DNA is oversupercoiled macromolecule with ~2 A rise per nucleotide pair Summary The supercoiled pGEMEX DNA with length of 3993 nucleotides was immobilized on different substrates (freshly cleaved mica, standard aminomica, modified aminomica with increased and decreased aminogroups surface density comparing with standard aminomica) and studied by the atomic force microscopy. The DNA molecules with extremely high level of supercoiling were visualized on the modified aminomica with increased surface charge density. The rise per nucleotide pair was determined by measurement of a contour length of single oversupercoiled DNA molecules. The rise value per nucleotide pair varied from H-1.94 A up to H-2.19 A for different molecules. These spring-like compressed supercoiled DNA 523 ЛИМАНСЬКА О. Ю., ЛИМАНСЬКА Л. О., ЛИМАНСЬКИЙ О. П. molecules with decreased rise in comparison with well known DNA forms were referred to the new DNA form, called S-DNA. Key words: superceded DNA, atomic force microscopy, amino- mica, oversupercoiled DNA, S-DNA. О. Ю. Лиманская, Л. А. Лиманская, А. П. Лиманский S-Форма ДНК — сверхсуперспирализованная макромолекула с межнуклеотидным расстоянием ~2 А вдоль оси дуплекса Резюме С использованием атомно-силовой микроскопии визуализиро вана суперспирализованная ДНК pGEMEX длиной 3993 пары нуклеотидов, иммобилизованная на различных субстратах (свежесколотой слюде, стандартной аминослюде и модифици рованной аминослюде — с повышенной и пониженной поверхно стной плотностью аминогрупп по сравнению со стандарт ной). На модифицированной аминослюде, характеризующейся повышенной поверхностной плотностью заряда, визуализиро ваны молекулы ДНК с чрезвычайно высоким уровнем суперспи- рализации. Измерение контурной длины единичных суперспира- лизованных молекул ДНК позволило определить расстояние между нуклеотидами вдоль оси двойной спирали, варьирующее от Н-1,94 до 2,19 А для разных молекул Такие сжатые подобно пружине суперспиральные молекулы ДНК с уменьшен ным межнуклеотидным расстоянием по сравнению с извест ными формами ДНК были отнесены к новой форме ДНК — S-ДНК Ключевые слова: суперспиральная ДНК, атомно-силовая микроскопия, аминослюда, сверхсуперспиральная ДНК, S-ДНК. ПЕРЕЛІК ЛІТЕРАТУРИ 1. Иванов В. И. Двойная спираль ДНК / / Молекуляр. био логия.—1983.—17, № 3.—С. 616—621. 2. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеи новых кислот.—М.: Мир, 1987.—584 с. 3. Wang J. С. Helical repeat of DNA in solution / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1979.—76.—P. 200—203. 4. Lyubchenko Y, Jacobs В., Lindsay S. Atomic force microscopy of reovirus dsRNA: a routine technique for length measurement / / Nucl. Acids Res.—1992. —20.—P. 3983—3986. 5. Lyubchenko Y., Gall A., Shlyakhtenko L., Harrington R., Jacobs В., Oden P., Lindsay S. Atomic force microscopy imaging of double stranded DNA and RNA II i. Biomol. Struct, and Dyn.—1992.—10.—P. 589—606. 6. Hinterdorfer P., Baumgartner W., Gruber H., Schilcher K., Schindler H. Detection and localization of individual an tibody—antigen recognition events by atomic force microscopy / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1996. —93. —P. 3477—3481. 7. Моу V., Florin E.-L., Gaub H. Intermolecular forces and energies between ligands and receptors / / Science.—1994.— 266—P. 257—259. 8. Lyubchenko Y., Shlyakhtenko L. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ II Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1997.—94.—P. 496—501. 9. Cherny D., Jovin T. Electron and scanning force microscopy studies of alterations in supercoiled DNA tertiary structure / / J. Мої. Biol.—2001.—313.—P. 295—307. 10. Boles Т., White, Cozzarelli N. Structure of plectonemically supercoiled DNA / / J. Мої. Biol.—1990.—213.—P. 931— 951. 11. Tanigawa M., Okada T. Atomic force microscopy of super coiled DNA structure on mica / / Anal. Chim. Acta.—1998.— 365.—P. 19—25. 12. Bussiek M., Mucke N., Langowski J. Polylysine-coated mica can be used to observe systematic changes in the supercoiled DNA conformation by scanning force microscopy in solution / / Nucl. Acids Res.—2003.—31.—P. 1 — 10. 13. Кузнецов И. А., Королев H. И., Филиппов С. М., Хамизов P. X. Компактизация ДНК, вызываемая протонированием. Кондуктометрическое титрование изоионных растворов и ионообменные свойства иммобилизованной ДНК / / Моле куляр. биология.—1983,—17, № 1.—С. 153—161. 14. Vologodskii A., Levene D., Klenin К, Frank-Kamenetskii М., Cozzarelli N. Conformation and thermodynamics of supercoiled DNA / / J. Мої. Biol.—1992.—227.—P. 1224—1243. 15. Fujimoto В., Schurr /.Monte Carlo simulations of supercoiled DNAs confined to a plane / / Biophys. J.—2002.—82.— P. 944—962. 16. Velichko Y., Yoshikawa K, Khokhlov A. Effect of twisting on the behavior of a double-stranded polymer chain: a Monte- Carlo simulation / / J. Chem. Phys.—1999— 111 — P. 9424— 9433. 17. Rybenkov V., Vologodskii A., Cozzarelli N. The effect of ionic conditions on DNA helical repeat, effective diameter and free energy of supercoiling / / Nucl. Acids Res.—1997.—25.— P. 1412—1418. 18. Limansky A., Shlyakhtenko L, Schaus S., Henderson E., Lyubchenko Y. Aminomodified probes for atomic force micros copy / / Probe microsc.—2002.—2.—P. 227—234. 19. Butt H. Measuring electrostatic, van der Waats, and hydration forces in electrolyte solutions with an atomic force microscope / / Biophys. J.—1991.—60.—P. 1438—1444. 20. Hansma H., Golan R., Hsieh W., Daubendiek S., Kool E. Polymerase activities and RNA structures in the atomic force microscope / / J. Struct. Biol.—1999.—127.—P. 240—247. 21. Лиманский А. П. Исследование аминомодифицированных зондов для атомно-силовой микроскопии биомолекул / / Біополімери і клітина.—2002.—18, № 1.—С. 62—70. 22. Вологодский А. В. Топология и физические свойства коль цевых ДНК—М.: Наука, 1988.—192 с. 23. Rivetti С, Codeluppi S., Died G., Bustamante С. Vizualizing RNA extrusion and DNA wrapping in transcription elongation complexes of bacteriae and eukaryotic RNA polymerases III. Мої. Biol.—2003.—326— P. 1413—1426. 24. Leuba S., Karymov M., Tomschik M., Ramjit R., Smith P., Zlatanoya J. Assembly of single chromatin fibers depends on the tension in the DNA molecule: magnetic tweezers study / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—2003.—100—P. 495—500. 25. Мазур Дж., Джерниган P. Л., Сараи А. Конформационные эффекты при растяжении ДНК / / Молекуляр. биология.— 2003.—37, № 2.—С. 277—287. 26. Лиманський О. П., Лиманська О. Ю. Вивчення геномної ДНК мікроорганізмів методом атомно-силової мікроскопії / / Цитология и генетика.—2002.—36, № 4. С. 30—36. 27. Лиманский А. П. Атомно-силовая микроскопия: от визуа лизации молекул ДНК и белков до измерения силы меж молекулярных взаимодействий / / Успехи соврем, био логии.—2003.—123, № 6.—С. 531—542. 28. Newlin D., Miller К., Pilch D. Interactions of molecules with nucleic acids. VII. Intercalation and ТА specificity of dau- nomycin in DNA / / Biopolymers.—1984 —23.— P. 139—158. 29. Frank-Kamenetskii M. DNA supercoiling and unusual struc tures DNA topology and biological effects/DNA topology and its biological effects / Eds N. Cozzarelli, J. Wang.—New York: Cold Spring Harbor Lab. press, 1990.—P. 186—215. УДК 577.2:577.32 Надійшла до редакції 16.03.05 524

S-Форма ДНК – надсуперспіральна макромолекула з міжнуклеотидною відстанню ~2 Å уздовж осі дуплексу

Репозитарії

Схожі ресурси