Створення продуцентів нових полікетидних антибіотиків методами генетичної інженерії

Створення продуцентів нових полікетидних антибіотиків методами генетичної інженерії

Зроблено огляд сучасних експериментальних даних в галузі вивчення біосинтезу полікетидів – однієї з найбільших груп природних сполук, що проявляють широкий спектр цінних біологічних властивостей. Розуміння генетичних та біохімічних аспектів полікетидного синтезу дозволяє створити рекомбінантні штами...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Date:2002
Main Authors: Осташ, Б.О., Федоренко, В.О.
Format: Article
Language:Ukrainian
Published: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2002
Series:Біополімери і клітина
Subjects:
Огляди
Online Access:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156318
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:Створення продуцентів нових полікетидних антибіотиків методами генетичної інженерії / Б.О. Осташ, В.О. Федоренко // Вiopolymers and Cell. — 2002. — Т. 18, № 6. — С. 467-477. — Бібліогр.: 56 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-156318
record_format dspace
spelling nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1563182025-02-05T20:29:34Z Створення продуцентів нових полікетидних антибіотиків методами генетичної інженерії Создание продуцентов новых поликетидных антибиотиков с помощью методов генетической инженерии Gene engineering of novel polyketide antibiotics producers Осташ, Б.О. Федоренко, В.О. Огляди Зроблено огляд сучасних експериментальних даних в галузі вивчення біосинтезу полікетидів – однієї з найбільших груп природних сполук, що проявляють широкий спектр цінних біологічних властивостей. Розуміння генетичних та біохімічних аспектів полікетидного синтезу дозволяє створити рекомбінантні штами мікроорганізмів, що продукують нові сполуки з передбачуваною структурою. Описано основні методи генетичного «дизайну» нових полікетидних сполук, наведено приклади геноінженерного конструювання продуцентів промислово важливих полікетидних ан­тибіотиків. Current understanding of the polyketide antibiotics synthesis is reviewed. Detailed heuristics in both genetic and biochemical aspects of polyketide synthesis allows to create the recombinant strains – producers of new polyketides with predicted structure. Methods for rational genetic «design» of hybrid compounds are described and examples of engineered synthesis of the industrially important polyketide antibiotics are given. Сделан обзор современных экспериментальных данных в обла­сти исследований биосинтеза поликетидов – одной из наиболь­ших групп природных соединений, проявляющих ряд ценных биологических свойств. Понимание генетических и биохимиче­ских аспектов поликетидного синтеза позволяет создавать рекомбинантные штаммы микроорганизмов, продуцирующие соединения с заданной структурой. Описаны основные методы генетического «дизайна» новых поликетидных соединений, при­ведены примеры геноинженерного конструирования продуцен­тов промышленно важных поликетидных антибиотиков. 2002 Article Створення продуцентів нових полікетидних антибіотиків методами генетичної інженерії / Б.О. Осташ, В.О. Федоренко // Вiopolymers and Cell. — 2002. — Т. 18, № 6. — С. 467-477. — Бібліогр.: 56 назв. — укр. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.000629 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156318 576.8.095.382 uk Біополімери і клітина application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Ukrainian
topic Огляди
Огляди
spellingShingle Огляди
Огляди
Осташ, Б.О.
Федоренко, В.О.
Створення продуцентів нових полікетидних антибіотиків методами генетичної інженерії
Біополімери і клітина
description Зроблено огляд сучасних експериментальних даних в галузі вивчення біосинтезу полікетидів – однієї з найбільших груп природних сполук, що проявляють широкий спектр цінних біологічних властивостей. Розуміння генетичних та біохімічних аспектів полікетидного синтезу дозволяє створити рекомбінантні штами мікроорганізмів, що продукують нові сполуки з передбачуваною структурою. Описано основні методи генетичного «дизайну» нових полікетидних сполук, наведено приклади геноінженерного конструювання продуцентів промислово важливих полікетидних ан­тибіотиків.
format Article
author Осташ, Б.О.
Федоренко, В.О.
author_facet Осташ, Б.О.
Федоренко, В.О.
author_sort Осташ, Б.О.
title Створення продуцентів нових полікетидних антибіотиків методами генетичної інженерії
title_short Створення продуцентів нових полікетидних антибіотиків методами генетичної інженерії
title_full Створення продуцентів нових полікетидних антибіотиків методами генетичної інженерії
title_fullStr Створення продуцентів нових полікетидних антибіотиків методами генетичної інженерії
title_full_unstemmed Створення продуцентів нових полікетидних антибіотиків методами генетичної інженерії
title_sort створення продуцентів нових полікетидних антибіотиків методами генетичної інженерії
publisher Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate 2002
topic_facet Огляди
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/156318
citation_txt Створення продуцентів нових полікетидних антибіотиків методами генетичної інженерії / Б.О. Осташ, В.О. Федоренко // Вiopolymers and Cell. — 2002. — Т. 18, № 6. — С. 467-477. — Бібліогр.: 56 назв. — укр.
series Біополімери і клітина
work_keys_str_mv AT ostašbo stvorennâproducentívnovihpolíketidnihantibíotikívmetodamigenetičnoíínženeríí
AT fedorenkovo stvorennâproducentívnovihpolíketidnihantibíotikívmetodamigenetičnoíínženeríí
AT ostašbo sozdanieproducentovnovyhpoliketidnyhantibiotikovspomoŝʹûmetodovgenetičeskojinženerii
AT fedorenkovo sozdanieproducentovnovyhpoliketidnyhantibiotikovspomoŝʹûmetodovgenetičeskojinženerii
AT ostašbo geneengineeringofnovelpolyketideantibioticsproducers
AT fedorenkovo geneengineeringofnovelpolyketideantibioticsproducers
first_indexed 2025-11-25T07:19:52Z
last_indexed 2025-11-25T07:19:52Z
_version_ 1849745939465502720
fulltext ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2002. Т. 18. № 6 ОГЛЯДИ Створення продуцентів нових полікетидних антибіотиків методами генетичної інженерії Б. О. Осташ, В. О. Федоренко Львівський національний університет імені Івана Франка Вул. Грушевського, 4, Львів, 79005, Україна Зроблено огляд сучасних експериментальних даних в галузі вивчення біосинтезу полікетидів — однієї з найбільших груп природних сполук, що проявляють широкий спектр цінних біологічних властивостей. Розуміння генетичних та біохімічних аспектів полікетидного синтезу дозволяє створити рекомбінантні штами мікроорганізмів, що продукують нові сполуки з передбачуваною структурою. Описано основні методи генетичного «дизайну» нових полікетидних сполук, наведено приклади геноінженерного конструювання продуцентів промислово важливих полікетидних ан­ тибіотиків. Вступ. Полікетиди — це велика група природних сполук, які синтезуються шляхом повторюваної конденсації коротких ацильних залишків (ацетил- КоА, пропіоніл-КоА та ін.) [1 ]. Полімер, що утво­ рюється, надалі зазнає низки ферментативних мо­ дифікацій (кеторедукція, циклізація, гідроксилю- вання, глікозилювання тощо), набір яких є харак­ терним для біосинтезу тієї чи іншої сполуки [2]. Полікетиди проявляють бактерицидні, фунгіцидні, противірусні, протипухлинні, антигельмінтні, іму- носупресорні властивості і використовуються в ме­ дицині, сільському господарстві та ветеринарії [З, 4 ]. Більшість біологічно активних полікетидів син­ тезується актиноміцетами — грампозитивними бактеріями з розвиненим вторинним метаболізмом. Розробка хімічних та біологічних методів одер­ жання нових антибіотиків посідає значне місце в роботах, присвячених вивченню вторинного мета­ болізму в актиноміцетів [3—6]. Сьогодні цей на­ прям наукового пошуку набув особливої актуаль­ ності, що пов'язано, насамперед, з появою клі­ нічних штамів мікроорганізмів, стійких до відомих антибіотиків, пухлин, які проявляють множинну резистентність до протипухлинних засобів [7]. За останні роки показана також перспективність вико­ ристання природних полікетидів як противірусних і гербіцид них агентів [4, 8 ]. Полікетидні антибіотики є сполуками, хіміч- © Б. О. ОСТАШ, В. О. ФЕДОРЕНКО, 2 0 0 2 ний синтез чи модифікація яких є надзвичайно складним і економічно невигідним процесом. Це зумовлює значний інтерес до геноінженерних ме­ тодів створення нових полікетидів. Маніпуляції з генами вторинного метаболізму в актиноміцетів дозволяють конструювати нові біосинтетичні шля­ хи і змінювати існуючі. Сучасна методологічна база молекулярної біології розвинута достатньо, щоб отримувати мікроорганізми, які продукувати­ муть групи хімічно споріднених сполук («хімічні бібліотеки») із заздалегідь передбачуваною струк­ турою («генетичний дизайн полікетидів») [9 ]. Однак потенціал методів генетичної інженерії не може бути розкритий повністю без досконалого розуміння генетики і біохімії полікетидного синте­ зу. Тому особливо важливими є роботи, спрямовані на вивчення біосинтезу полікетидних антибіотиків в актиноміцетів, зокрема, у модельних штамів — продуцентів еритроміцину Saccharopolyspora егу- thraea, тетраценоміцину Streptomyces glaucescens і актинородину Streptomyces coelicolor A3 (2) [10, 11], встановлення принципів та механізмів, які б мали універсальний характер. Метою даного огляду є висвітлення сучасних досягнень і проблем у вивченні полікетидного синтезу та геноінженерного конструювання продуцентів нових полікетидних антибіотиків. Синтез жирних кислот (СЖК) і синтез по­ лікетидів — подібності і відмінності. Полікетидний синтез в актиноміцетів відбувається за схемою 467 ОСТАПІ Б. О., ФЕДОРЕНКО В. О. СЖК в про- та еукаріотів. У складі синтаз жирних кислот (СЖК-комплекси), як і в полікетидсин- тазах (ПКС), є кетоацилсинтаза (КС а), ацилтранс- ферази (AT) та ацилпереносний білок (АПБ), що каталізують синтез первинного вуглецевого ланцю­ га [12]. За аналогією до СЖК-комплексів, ПКС поділяють на два типи. ПКС І типу є мульти- функціональними білками. Один поліпептид міс­ тить домени, що проявляють усі ферментні актив­ ності, необхідні для одного чи кількох циклів /3-кетоконденсації—редукції. Кожна нова біосинте- тична реакція каталізується іншим доменом і кіль­ кість циклів конденсації визначається кількістю доменів-кетосинтаз. Характерними рисами ПКС І типу є конвейєрний принцип синтезу полікетид­ ного ланцюга (на відміну від циклічного у ПКС II типу) і ковалентна асоціація ферментів-доменів. Найдетальніше вивчено ПКС І типу, яка задіяна в синтезі еритроміцину у Saccfu erythraea [11]. ПКС II типу є набором окремих ферментів, що об'єднуються у функціональну одиницю, яка ка­ талізує поступову конденсацію ацильних поперед­ ників. Така ПКС є нековалентним асоціатом біл­ ків. Гени, що кодують ці білки, зібрані в хромосомі у кластер. Прикладом такої мультикомпонентної синтази є ПКС, що бере участь в синтезі актино- родину в S. coelicolor A3 (2) [13]. За останні роки виявлено, що актиноміцети здатні продукувати полікетиди, в синтезі яких задіяна принципово інша ферментна система (від­ сутній АПБ, нема гомології до ПКС І і II типів). Так, із Streptomyces griseus клонували ген гррА, що кодує білок з 327 амінокислотних залишків і є дуже подібним до халконсинтаз, які беруть участь в синтезі флавоноїдів у вищих рослин. Показано, що гомодимер RppA каталізує синтез пентакетиду, який далі спонтанно циклізується [15]. Є ряд відмінностей між СЖК та синтезом полікетидів. Для СЖК характерним є завершений цикл редукції кетогрупи в метиленову, кінетичний контроль довжини вуглецевого ланцюга (синте­ зується переважно пальмітат, С 1 6 ) , використання виключно ацетил-КоА для побудови жирної кисло­ ти [2]. Полікетидному синтезу ж притаманні ва­ ріативність циклу кеторедукції, використання шир­ шого кола ацильних попередників, генетичний контроль довжини полікетиду (С 7—С 5 0), наявність великої групи генів, що контролюють модифікацію первинного полі-/?-кетоновоп> ланцюга. ПКС І типу: синтез еритроміцину А в Sacch. erythraea. Еритроміцин А (Ег) — промислово важ­ ливий полікетидний антибіотик, що належить до класу макролідів. Його макролактон (дезоксиерит- ронолід В; DEB) синтезується з однієї молекули пропіоніл-КоА і шести — метилмалоніл-КоА. Сек- венування кластеру генів біосинтезу Ег (егу-кла- стер) зробило можливим ідентифікацію генів, що контролюють синтез DEB (гени eryAl, erykl, егукЪ) і модифікацію лактону. Гени eryBI-BVII, eryCI-CVI контролюють синтез цукрів дезозаміну і кладинози та відповідно їхнє приєднання до DEB, егуК, eryF — С12- і Сб-гідроксилювання DEB, eryG — метилювання кладинози. Ген егтЕ кодує метилтрансферазу 23S рРНК (рис 1). Таке мети­ лювання надає клітинам Sacch. erythraea стійкості до власного антибіотика [14]. Синтез DEB каталізують три гігантські (більше 3000 амінокислотних залишків кожен) мульти- функціональні білки — DEBS1, DEBS2, DEBS3, що кодуються відповідно генами егуАІ, eryhl, егуАЗ. Фрагмент DEBS-білка, який проявляє певну ка­ талітичну активність, назвали доменом. У межах поліпептиду окремі домени набувають власної гло­ булярної структури, яка не залежить від просторо­ вої структури сусідніх доменів. Сукупність доменів, необхідних для проходження одного циклу нарощу­ вання і кеторедукції полікетидного ланцюга, назва­ на модулем [11 ] (рис. 1). В ПКС з егдмкластеру на один білок припадає два модулі. Загалом є шість модулів, кожен з яких містить кетосинтазні та ацилтрансферазні домени, що дозволяє провести шість конденсацій. На N-кінці DEBS1 є стартовий модуль для введення першого ацильного залишку (пропіонату), який містить AT- і АПБдомени. Ос­ танній, шостий модуль, закінчується тіоестеразним доменом (ТЕ), що каталізує вивільнення з тіо- ефірного зв'язку та лактонізацію полікетидного інтермедіату [13]. Така організація ПКС-комплек- су дозволяє на кожному етапі конденсації вводити наступний ацильний залишок, відмінний за будо­ вою від попередніх, і досягти великої структурної різноманітності лактонів, що синтезуються [16]. Спостерігається колінеарність у розташуванні егуЛ-генів та порядку участі кодованих ними білків у синтезі лактонного кільця. Вищенаведені факти щодо генетичного контролю синтезу DEB свідчать про конвеєрний принцип функціонування ПКС І типу. Правильність такого припущення підтверд­ жується результатами експериментів із спрямова­ ного руйнування окремих доменів [1, 11, 13]. їхня інактивація спричинювала зміну структури в очі­ куваній позиції, яку можна передбачити, виходячи з модульної організації ПКС. Важливим є той- факт, що змінений інтермедіат — результат му­ тації в одному з доменів п'ятого модуля — сприй­ мався як субстрат доменами шостого. Отже, пере­ несення проміжного продукту з одного модуля на інший є функцією специфічного впорядкування 468 СТВОРЕННЯ ПРОДУЦЕНТІВ НОВИХ ПОЛІКЕТИДНИХ АНТИБІОТИКІВ Рис. 1. Синтез еритроміцину [11]: а — організація кластеру генів біосинтезу еритроміцину Sacch. erythraea (функції генів —див. текст; напрям стрілок на генетичній карті кластеру позначає напрям транскрипції генів); б — схема синтезу еритроноліду та його модифікація (кільцями в схемі синтезу еритроноліду позначено окремі домени: AT — ацилтрансфераза; КС — кетосинтаза; КР — кеторедуктаза; АПБ — ацилпереносний білок; ДГ — дегідратаза; ЕР — еноілредуктаза; міжмодульні та міжбілкові лінкерні по­ слідовності не представлені) ПКС-модулів, а не їхньої структурної комплемен- тарності до певних полікетидних ланцюгів [11]. В ході експериментів з геноінженерного конструю­ вання рекомбінантних ПКС І типу, що містили модулі з продуцентів різних макролідних полі­ кетидів (гетерологічні модулі), виявлено, що ви­ рішальну роль при впорядкуванні DEBS-білків ві­ діграють міжбілкові лінкери — ЗО—40 N-кінцевих амінокислотних залишків, переважно гідрофільних. Лінкери, що з'єднують модулі в межах одного 469 ОСТАПІ Б. О., ФЕДОРЕНКО В. О. Рис. 2. Схема синтезу попередника тетраце- номіцину С — тетраценоміцину F2 [27]. Умо­ вні позначення: ТстК — кетосинтаза; TcmL — фактор контролю довжини ланцюга; ТстМ — ацилпереносний білок; TcmJ — білок — стабі­ лізатор комплексу мінімальної ПКС; TcmN — циклаза-О-метилтрансфераза; FabD — ацилт- рансфераза поліпептиду (міжмодульні лінкери), є короткими. В них присутній консервативний залишок проліну [17, 18]. Гени егуАІу егуА2, егуАЗ фланковані двома групами генів [19, 20]. Кодовані ними білки ка­ талізують модифікації первинного лактону (рис* 1, а). Приєднання дезоксицукрів до DEB є важливим з огляду на те, що лише глікозильований еритро- нолід проявляє антибіотичну активність. Показано, що глікозилтрансферази EryBV і ЕгуСШ здатні приєднувати цукрові залишки до субстратів, від­ мінних від DEB. У той же час білки EryF і ЕгуК (цитохром Р-450 оксигенази) проявляють високу субстратну специфічність [1, 14]. Генетичні де­ термінанти для компонентів електротранспортно­ го ланцюга оксигеназ і для ферментів приєднання пантотенової кислоти до АПБ та окремих етапів синтезу дезоксицукрів не входять в егу-класгер [П , 14, 20]. На сьогодні виявлено, що ПКС І типу бере участь у синтезі таких важливих макролідних спо­ лук, як рапаміцин, авермектин, ланкаміцин; по­ ліефірів — монензину і нігерицину, макротетро- лідів, полієнів (ністатину) [1, 13, 21—25]. Гене­ тична та функціональна організація цих ПКС є складнішою за організацію ПКС в *?гу-кластері. Це виражається в неколінеарності розташування генів та порядку участі в синтезі полікетиду кодованих ними білків, наявності спеціальних доменів для введення в склад полікетидного ланцюга аміно­ кислот або інтермедіатів їхнього метаболізму (син­ тез рапаміцину, авермектинів, ланкаміцинів) [25], «мовчазних» доменів чи відсутності АПБ-доменів (біосинтез авермектинів і макротетролідів відпо­ відно) [22]. ПКС II типу — синтез ароматичних поліке­ тидних антибіотиків. Ароматичні полікетидні ан­ тибіотики є структурно простішими за продукти каталітичної активності ПКС І типу, що відобра­ жає простішу генетичну організацію ПКС II типу. Це пов'язано з тим, що ароматичні полікетиди синтезуються переважно з ацетил-КоА, бо цик­ лічний механізм функціонування ПКС II типу не дозволяє вводити різні ацильні залишки в процесі синтезу одного полікетидного ланцюга [26]. На сьогодні клоновано більше 20 кластерів генів біо­ синтезу ароматичних полікетидних антибіотиків [13]. Найдетальніше генетичні та біохімічні аспек­ ти синтезу ароматичних полікетидних антибіотиків вивчено в продуцентів декакетидного (полікето- новий ланцюг складається з 20 атомів вуглецю; С 2 0) антибіотика тетраценоміцину С (ТсС) 5. glau- cescens [27 ] і октакетидного антибіотика актиноро- дину (Аг; С 2 0) S. coelicolor A3(2) [9, 13]. Схема синтезу полікетидного попередника ТсС представ­ лена на рис 2. Організація генів їхнього біосинтезу є типовою для кластерів генів біосинтезу ароматичних полі­ кетидних антибіотиків (рис 3). Центральне місце в них займають три гени, що контролюють цик­ лічний процес /?-кетоконденсації [28 ]. Один з них кодує кетосинтазу КС а (гени tcmK і «асЙ-ORFI в S. glaucescens та S. coelicolor A3(2) відповідно). Дру­ гий ген кодує білок КС^, який забезпечує включен­ ня першого ацильного залишку та контролює до­ вжину полікетидного ланцюга (tenth і ясД-ORFII) [9], а третій —АПБ (tcmU і асД-ORFIII) [2]. В більшості випадків ці гени формують єдину транс­ крипційну одиницю. Комплекс білків КС Л , КС^, АПБ та AT, що постачається з первинного мета- 470 СТВОРЕННЯ ПРОДУЦЕНТІВ НОВИХ ПОЛІКЕТИДНИХ АНТИБІОТИКІВ болізму [1, 27], каталізує формування первинного полі-/?-кетонового ланцюга. Цей комплекс отримав назву «мінімальна ПКС». Решта білків, що коду­ ються кластерами, модифікують утворений інтер- медіат, регулюють його синтез та експорт, надають клітинам продуцента стійкості до власного ан­ тибіотика. З мінімальною ПКС взаємодіють поліке- тидкеторедуктази (КР) та полікетидциклази/аро- матази (ПЦ), які каталізують перші реакції мо­ дифікації полікетидного ланцюга (інтегральні компоненти) [29]. Інші ферменти (неінтегральні компоненти) діють на частково циклізований ін- термедіат після того, як він відділився від мі­ німальної П К С На відміну від генів ПКС І типу, секвенування та інактивація генів біосинтезу ароматичних полі­ кетидів не завжди чітко вказували на функцію кодованих ними білків [6, 10]. Тому у з'ясуванні механізму функціонування ПКС II типу важливу роль відіграють експерименти з гетерологічної екс­ пресії їхніх генів. Виявлено, що мінімальна ПКС контролює вибір стартового ацильного залишку, яким переважно є ацетил-КоА [30 ]. У двох випад­ ках — в біосинтезі даунорубіцину в S. peucetius та окситетрацикліну в S. rimosus — формування по­ лікетидного каркасу розпочинається не з ацетил- КоА, а з пропіоніл- і малонаміл-КоА відповідно. В кластерах генів синтезу цих сполук виявлено спе­ ціальні гени, що контролюють вибір саме цих стартових залишків [2, 31 ]. Для мінімальної ПКС з acf-кластеру показано, що КС^ володіє декарбо- ксилазною активністю. В стартових модулях дея­ ких ПКС І типу також виявлено домен, що містить декарбоксилазний активний центр і забезпечує іні­ ціацію полікетидного синтезу. Це вказує на існу­ вання спільних рис у генетичному контролі вибору першого ацильного залишку у ПКС І і II типів [9 ]. В генах для КС^ з tern- і ясґ-кластерів локалізували послідовність, що кодує 57 амінокислотних за­ лишків. Цей амінокислотний мотив відіграє ви­ рішальну роль у визначенні кількості циклів £-ке- токонденсації. Рекомбінантна ас*-ПКС, у якій цей мотив замінили на гетерологічний з fcm-ПКС, синтезувала декакетидні ланцюги, а не октакетидні [28]. Але вплив на цей процес мають також і інтегральні компоненти ПКС. Так, мінімальна ПКС з кластеру и>/ц-генів, що контролюють споро­ вий пігмент полікетидної природи S. coelicolor A3 (2), здатна синтезувати С 2 2 - і С 2 4-ланцюги. Ко- експресія генів whiE ORF 1, 2, 3 мінімальної ПКС з геном циклази w/u'E-ORFVI спричинює синтез виключно С 2 4-ланцюгів [13]. Подібні зміни спо­ стерігаються при спільній експресії генів мінімаль­ ної ПКС одного біосинтетичного шляху і генів 2 3 5 4 4 1 2 3 5 ind ШШШМШШШ^О Е ^ = Н Ш Ш [ П > 1 2 3 5 4 Рис 3. Генетична організація комплексів полікетидсинтаз з кластерів генів біосинтезу тетраценоміцину С item), актиноро- дину (act), спорового пігменту yfh(whiE), урдаміцинів (urd), мітраміцину (mtm), ландоміцину Е (Ind) [13, 40]. Цифрами позначено гени, що кодують: У — кетоацилсинтазу (КС а); 2 — КС^; 3 — ацилпереносний білок; 4 — полікетидциклази/арома- тази; 5 — полікетидкеторедуктази модифікації полікетидного ланцюга — іншого [1, 32, 33]. Отже, коекспресія генів гомологічних чи гете- рологічних інтегральних компонентів з мінімаль­ ною ПКС веде до якісних і кількісних змін у її функціонуванні [29 ]. Для ПКС II типу не виявле­ но генів, які б кодували ТЕ. Поки що важко пояснити, як проходить вивільнення полікетиду з ПКС-комлексу для його подальшого процесингу неінтегральними білками. Можливо, цей процес контролюється АТ-мотивом КС а або ж відбувається спонтанно (за аналогією із синтезом 6-метилса­ ліцилової кислоти). Не виключено, що він ка­ талізується відповідними ферментами із СЖК-ком- плексу [33]. Характерною рисою кластерів генів синтезу ароматичних полікетидів є наявність великої групи генів, що контролюють реакції «дозрівання» лі­ нійного полі-^З-кетонового ланцюга. До них насам­ перед належать кеторедукція, інтрамолекулярні альдольні конденсації/аддукції, формування нена- сичених зв'язків у кільцях («ароматизація»), окис­ лення, алкілювання, декарбоксилювання, глікози- лювання та ін. Перші модифікаційні реакції — редукція і циклізація визначають характерну стру­ ктуру даної сполуки. Кеторедуктаза взаємодіє з мінімальною ПКС і відновлює в полікетидному ланцюзі, що синте­ зується, карбонільну групу до метиленової. КР з кластеру генів синтезу Аг S. coelicolor A3 (2) від­ новлює кетогрупу в положенні С9 і зберігає здат­ ність до С9-кеторедукції на ланцюгах завдовжки 471 ОСТАШ Б. О., ФЕДОРЕНКО В. О. С,6—-С24 [13, 34]. Загалом КР проявляють низьку субстратну специфічність [35]. У деяких кластерах не виявлено генів, які кодують КР (ґстя-кластер S. glaucescens). Тип першої циклізації первинного полікетид- ного ланцюга залежить від активності полікетид- циклази і сайта кеторедукції, якщо остання харак­ терна для синтезу даного антибіотика. Так, при С9-кеторедукції проходить альдольна конденсація між С7 і С12, при С7-кеторедукції — між С5 і СЮ [34, 36]. ПЦ також мають відносно низьку суб­ стратну специфічність. Циклаза TcmN функціонує на окта- і декакетидах, ActIV — на С, ь- і С | 8 - , але не на С2 0-ланцюгах [13]. Інші реакції модифікації є специфічними для синтезу певного полікетиду. Саме активність окси- геназ, метил- і глікозилтрансфераз, що «оздоблю­ ють» циклізований інтермедіат, визначає унікаль­ ність його біологічної дії. В гетерологічних умовах вищезгадані білки демонструють субстратну «гнуч­ кість» — вони здатні вводити відповідні функціо­ нальні групи в різні ділянки того ж полікетиду чи сприймати різні полікетидні каркаси як субстрат [2, 4, 28, 37]. Більшість оксигеназ, що беруть участь у синтезі ароматичних полікетидних ан­ тибіотиків, не є цитохром Р450-залежними. З цим, можливо, і пов'язана їхня низька субстратна спе­ цифічність в гетерологічних умовах, тоді як Р-450 оксигенази є вузькоспецифічними [4, 11, 37]. Хоча окремі ферменти синтезу ароматичних полікетидів можуть каталізувати відповідні реакції з використанням альтернативних субстратів, у при­ родних умовах один кластер генів контролює син­ тез лише одного антибіотика [14, 38, 39], а інші полікетиди є інтермедіатами чи продуктами шунто­ вих реакцій. Очевидно, що в цих умовах усі білки ПКС-комплексу формують оптимальний фермент­ ний асоціат, у якому окремі ферменти зазнають певних конформаційних змін [1, 33]. Це веде до появи вузької субстратної специфічності в інте­ гральних компонентів ПКС-комплексу. Відтак не- інтегральним білкам біосинтезу ароматичних по­ лікетидних антибіотиків постачається лише один субстрат, який вони певним чином модифікують [29]. Експерименти з конструювання ПКС, субоди- ниці яких є різного походження, інколи спричиню­ ють синтез сполук з непередбачуваною структурою [28]. Це свідчить про потребу глибшого вивчення ПКС II типу. Принципи конструювання продуцентів нових полікетидів. Інженерія нових полікетидних сполук базується на низькій субстратній специфічності ферментів вторинного метаболізму та їхній здат­ ності функціонувати в гетерологічних умовах. Роз­ роблено три основних підходи до геноінженерного створення продуцентів нових полікетидів. Пер­ ший — це міжвидове клонування великих фраг­ ментів кластерів генів біосинтезу полікетидних сполук [13, 38, 40—43]. Такий метод грунтується на передбаченні того, що експресія клонованих генів призведе до модифікації антибіотика, який синтезується гетерологічним господарем, або ж ферменти, кодовані генами господаря, діятимуть на полікетид — результат експресії клонованих генів. Другий — це гетерологічна експресія окремих генів з відомими функціями. Цей підхід дозволяє отри­ мувати сполуки із заздалегідь передбачуваною структурою. Третій — це інактивація окремих ге­ нів методами спрямованого мутагенезу для отри­ мання проміжних продуктів і продуктів шунтових реакцій, що проявляють важливі біологічні власти­ вості. Дослідження показали, що є кілька умов, до­ тримання яких підвищує імовірність отримання нових сполук у результаті гетерологічної експресії макрофрагментів ДНК з генами біосинтезу полі­ кетидних сполук чи окремих генів [8, 14]. Перш за все, ферменти, що кодуються як генами клоновано- го фрагмента, так і генами господаря, повинні каталізувати синтез близьких за структурою спо­ лук (полікетидні ланцюги однакової довжини). Біл­ ки, які модифікують полікетидний ланцюг, мають проявляти розширену субстратну специфічність. Важливо, щоб новий полікетид, який утворюється в результаті спільної експресії клонованих генів та генів господаря, не був аутотоксичним. Коли ме­ ханізм захисту вихідного штаму від ендогенного антибіотика є неефективним у випадку «гібридної» сполуки, тоді слід створювати спеціальну систему для її видалення з клітин. Кандидатом на таку роль є широкоспецифічний АТР-залежний транспортер, клонований із штаму S. rochet Експресія цього білка надає стійкості клітинам S. lividans до ерит­ роміцину, спіраміцину, доксорубіцину і тетрацик­ ліну [44]. Маніпуляції з генами, що кодують ПКС І і II типів. Гени, що кодують ПКС І і II типів, широко використовуються в комбінаторному синтезі по­ лікетидів, але рекомбінантні ПКС І типу займають чільне місце в таких експериментах. Це пов'язано з високим потенціалом конструктивних можливо­ стей модульних П К С ПКС І типу використовують широкий спектр ацильних залишків і синтезують складні макролідні, поліефірні і полієнові сполуки. Модульна ПКС здатна формувати редуктивний цикл, що генерує п'ять функціональних груп (ке­ то-, R- і S-гідрокси-, еноїл- та метиленова групи) 472 СТВОРЕННЯ ПРОДУЦЕНТІВ НОВИХ ПОЛІКЕТИДНИХ АНТИБІОТИКІВ на кожному з п кроків нарощування ланцюга, теоретично даючи 5п варіантів синтезу (15625 для егу-ПКС), з яких реалізується один. Програмуван­ ня такого редуктивного циклу є поза функціо­ нальними можливостями ПКС II типу [13, 26]. Для ПКС II типу характерне жорстке програму­ вання вибору ацильних залишків, переважно аце- тил-КоА. Тому синтезуються відносно прості полі- кетиди, які набувають структурної різноманітності та певних біологічних властивостей після моди­ фікації. Прикладом маніпуляцій з ПКС І типу є ство­ рення рекомбінантних ПКС на основі DEB-синтази SaccK erythraea. На генному рівні АТ-домени і домени, що каталізують /?-кеторедукцію в DEBS, замінили на їхні аналоги з рапаміцин-синтази S. hygroscopicus, які кодують домени з іншими суб- стратними специфічностями і ферментними актив­ ностями. Рекомбінантні DEBS-білки з одиничними замінами комбінували для отримання пептидів з подвійними і потрійними заміщеннями доменів. Такі білки каталізували продукцію макролактонів з однією, двома чи трьома відповідними модифі­ каціями [40 ]. Здатність одночасно змінювати кіль­ ка каталітичних центрів ПКС демонструє мож­ ливість перетворення таких маніпуляцій в техно­ логічний процес для конструювання бібліотек нових полікетидів. Іншим підходом є конструювання рекомбінан­ тних ПКС шляхом заміни не окремих доменів, а цілих модулів-синтаз, підбираючи відповідні лін- кери для їхньої функціональної сумісності [17]. Таким способом вдалося отримати рекомбінантні DEBS-білки, в яких стартовий домен походив з рапаміцинсинтази і які синтезували похідні дезок- сиеритроноліду з включенням піпеколової кислоти як першого ацильного залишку [25, 28]. Нові лактони є субстратами як для хімічної, так і ферментативної модифікації відповідних функціо­ нальних груп. Для спрощення геноінженерних ма­ ніпуляцій з генами модульних синтаз розроблено метод, що передбачає клонування окремих ПКС- модулів на трьох різних плазмідах, експресія яких є сумісною в S. coelicolor СН999 та 5. lividans (мультиплазмідний підхід). Це перспективно при комбінуванні модулів ПКС, що походять з різних кластерів, і спрощує отримання мутацій в окремих доменах [41 ]. На основі цього підходу створено систему для глікозилювання нових лактонів з ви­ користанням широкоспецифічної глікозилтрансфе- рази з кластеру генів біосинтезу пікроміцину S, venezulae. Показано, що глікозильованим лактонам притаманна антибіотична активність [42 ]. Експресія мінімальної ПКС II типу в мутант­ них штамах актиноміцетів, які не утворюють жод­ них полікетидних антибіотиків [13], спричинювала синтез полікетидних ланцюгів, що, спонтанно цик- лізуючись, давали суміш сполук. У цій суміші переважала сполука з тим типом циклізації, який є найвигіднішим з термодинамічної точки зору [ЗО]. Продукти каталітичної активності ПКС II типу, які синтезують окта-, нона- і декакетиди, позбавлені антибіотичних властивостей. Перспек­ тивною є експресія мінімальних ПКС з кластерів генів біосинтезу сполук, ланцюг яких складається з більше ніж 20 вуглеців. Так, мінімальна ПКС S. coelicolor A3 (2), що задіяна в синтезі згаданого вище спорового пігменту (С 2 4 ) , в гетерологічних умовах здатна генерувати 30 полікетидів різної довжини і типу циклізації. Серед них виявлено сполуку TW93h з унікальним 2,4-діоксиадаманта- новим кільцем, що не має аналогів у природі, і речовини з такою структурою досі синтезували лише хімічним шляхом [43]. Експресія фрагментів ДНК, які несуть, крім генів мінімальної ПКС, інші генетичні детермі­ нанти, є найпоширенішим способом отримання «гі­ бридних» антибіотиків. У 1981 р. групою дослід­ ників на чолі з Д. Хопвудом отримано перші «гібридні» сполуки медерроміцин А і В та дигідро- гранатиродин як результат клонування генів біо­ синтезу актинородину в штами, що продукують хімічно споріднені сполуки [38 ]. Іншим прикладом комбінаторного синтезу «гі­ бридного» антибіотика є біосинтез тетраценоміцину М (ТсМ) у S. glaucescens (продуцент ТсС), в який клонували фрагмент m/m-кластеру генів синтезу протипухлинного антибіотика мітраміцину (Mt) S. argillaceus. Цей фрагмент містить гени ПКС, КР, ПЦ та оксигенази. Полікетидний інтермедіат у синтезі тетраценоміцину С — TcF2 — є також про­ міжним продуктом і в синтезі Mt. Тому TcF2 є субстратом і для КР, ПЦ та оксигеназ — продуктів mfm-кластеру. Таким чином, ТсМ — це результат спільної експресії генів з tern- (синтез TcF2 ) і тґт-кластерів (окислення і відновлення TcF2) [45]. Зі штаму S. olivaceus, продуцента протипух­ линного антибіотика елораміцину, клонували кла­ стер генів біосинтезу цієї сполуки. Зокрема, отри­ мали косміду 16F4, яка несе фрагмент згаданого кластеру, що контролює синтез попередника ело­ раміцину 8-диметил-ТсС Трансформація S. fra- diae, продуцента ангуциклінових антибіотиків ур- даміцинів (Ur), або 5. argillaceus космідою 16F4 призвела до продукції чотирьох нових глікози- льованих сполук. Цікаво, що залишки дезокси- цукрів приєднані до 8-диметил-ТсС в інших по- 473 ОСТАШ Б. О., ФБДОРЕНКО В. О. зиціях, ніж у Mt і Ur [46, 47 J. Це свідчить про те, що глікозилтраснферази з mtm- і ttrtf-кластерів володіють широкою субстратною специфічністю і можуть використовуватись для отримання нових полікетидів. 5. galilaeus продукує аклациноміцини та ціне- рубіни — антибіотики антрациклінової групи, що проявляють протипухлинні властивості. Експресія генів біосинтезу актинородину в S. galilaeus пока­ зала, що вони функціонують однаково в 5. coe­ licolor A3 (2) і в цьому гетерологічному господарі. Експресія ділянки кластеру генів синтезу /?-ро- доміцинів S. purpurascens в S. galilaeus веде до продукції ряду антрациклінів, що не є характерни­ ми для господаря. Ці сполуки несли нові метильні та гідроксильні групи або ж були позбавлені кар­ боксильної групи [48 ]. Маніпуляції з окремими генами, що контро­ люють модифікацію полікетидного каркасу. Ре­ акції окислення та глікозилювання циклізованого полікетиду привертають особливу увагу дослід­ ників, бо дозволяють отримати нові сполуки з цінними біологічними властивостями. Експресія в 5. galilaeus гена dnrF, що кодує аклавінон-11-гідроксилазу в 5. peucetius, веде до продукції нового антрацикліну—11-гідроксіакла- циноміцину [5] (рис. 4). Названа сполука є більш активною проти лейкемічних і меланомних рако­ вих клітин, ніж вихідний аклациноміцин. Цей приклад демонструє ефективність використання методів генетичної інженерії для отримання сполук з новими біологічними активностями. На сьогодні відомо ще кілька прикладів гетеро- логічної експресії оксигеназ. Так, у результаті експресії гена urdE (С12-гідроксилаза) з S.fradiae в S. glaucescens спостерігається синтез нового тетра­ ценоміцину — 6-гідрокситетраценоміцину С [47 ]. Виявлено дві оксигенази, здатні сприймати як суб­ страт полікетиди різної довжини. Зокрема, мак- ролідна P-450-гідроксилаза РісК S. venezulae здатна здійснювати гідроксилювання С 1 2 - і С м - кетолі- дів — сполук, які активні проти еритроміцин-стій- ких штамів мікроорганізмів. Це значно полегшує пошук нових терапевтично цінних макролідів [49 ]. Гідроксилазу NcnH з послабленою специфічністю стосовно довжини полікетидного ланцюга виявлено в кластері генів біосинтезу нафтоциклінонів S. агепае. Поруч з геном пспН розташований ген ncnD, що кодує циклазу-ароматазу, яка сприймає як субстрати С, 6- і С 2 0-ланцюги. Коекспресія ncnD з різними генами мінімальних ПКС веде до про­ дукції ряду нових полікетидів [50]. Це робить даний фермент цінним інструментом для моди­ фікації продуктів активності мінімальних ПКС різ- Рис 4. Комбінаторний синтез 11 -гідроксіаклациноміцину (3) в результаті експресії dnrF з кластеру генів біосинтезу доксо- рубіцину (У) S. peucetius в штамі — продуценті аклациноміцину (2) 5. galilaeus [47]. У молекулі доксорубіцину стрілкою позна­ чено гідроксильну групу, вводиться гідроксилазою DnrF. У молекулі 11-гідроксіаклациноміцину зірочкою позначено гід­ роксильну групу, введення якої каталізував Dnrf них продуцентів. Розроблено також підхід для ви­ явлення генів, що кодують білки з новими фермен­ тативними активностями, який грунтується на по­ ступовому клонуванні генів в один вектор та аналізі полікетидів, що продукуються лише за наявності мінімальної ПКС чи ПКС та інших білків у різних комбінаціях [51 ]. Увагу дослідників привертають також гени, які контролюють синтез та приєднання цукрів до аг­ лікону, адже саме глікозильний залишок протипух­ линних антибіотиків відповідає за їхнє зв'язування з ДНК, прояв антибіотичної активності у мак­ ролідів тощо [14]. На сьогодні клоновано гени біосинтезу цукрів з різних кластерів генів біосин­ тезу полікетидів та вивчено механізми їхнього функціонування [52—-54 ]. Зокрема, здійснено гете- рологічну експресію гена oleGl олеандрозилтранс- ферази з кластеру генів біосинтезу олеандоміцину. Ген oleGl експресували в подвійному мутанті Sacch. erythraea з делегованими генами глікозил- трансферази егуВУ та егуСШ. Рекомбінантний штам Sacch. erythraea AeryBV, AeryClll, oleGl син­ тезував новий лактон, до якого був приєднаний залишок рамнози в положенні СЗ [53 ]. 474 СТВОРЕННЯ ПРОДУЦЕНТІВ НОВИХ ПОЛІКЕТИДНИХ АНТИБІОТИКІВ Цікавою є проблема конструювання біосин- тетичних шляхів для продукції нових цукрів — компонентів полікетидів. Це значно збільшить спектр полікетидних сполук, які можна генерувати методами генетичної інженерії. Так, у синтезі амі- ноцукру даунозаміну, що входить до складу клі­ нічно важливого протипухлинного антибіотика до- ксорубіцину, бере участь 4-кеторедуктаза DnmV. Вона відновлює кетогрупу цукру в положенні С4 до гідроксогрупи. Ген dnmV інактивували методом спрямованого мутагенезу, і в мутантний штам ввели ген егуШУ з ery-кластеру Sacch. erythraea, що кодує 4-кеторедуктазу з протилежною стереоспе- цифічністю. Рекомбінантний штам продукував епі- рубіцин — сполуку, в якій гідроксильна група в СЗ-положенні аміноцукру мала протилежну орієн­ тацію, ніж у доксорубіцині [54 ]. Показано, що епірубіцин більш ефективний проти лейкемій, ніж доксорубіцин. Ще одним при­ кладом генетичної інженерії цукрів є гетерологічна експресія трьох генів, які контролюють метилюван- ня L-рамнози — дезоксицукру, що входить до скла­ ду молекули елораміцину (El). Е1 є антрациклін- подібним протипухлинним антибіотиком, що про­ дукується 5. olivaceus Tu2353. Показано, що дані метилази володіють розширеною субстратною спе­ цифічністю і здатні функціонувати на інших аг­ ліконах [55]. Продуцент урдаміцинів 5. fradiae зі зруйнова­ ним геном urdGTl продукує три нові сполуки, серед яких переважаючим є неглікозильований аналог UrA — UrJ. Ця сполука, на відміну від решти урдаміцинів, містить насичений С5—С6 зв'язок в ангулярній області урдаміцинону [4]. Така структурна особливість UrJ може бути наслід­ ком активності певної еноїлредуктази, що не йро- являється в клітинах дикого типу. Показано, що UrJ має кращі протипухлинні властивості, ніж UrA-E. Подібні експерименти з інактивації генів, що кодують ГТ, проведені зі штамом 5. argillaceus. Отримано нові сполуки, які за своєю активністю не поступаються кінцевому продукту — мітраміцину. Вони структурно подібні до сполук, виділених з Aspergillus niger, які пригнічують нейропептид-Y- рецептори [47]. Висновки. Геноінженерне конструювання про­ дуцентів біологічно активних полікетидних спо­ лук — порівняно нова галузь біотехнології. Вона базується на успіхах у клонуванні генів біосинтезу багатьох полікетидних антибіотиків, з'ясуванні ос­ новних принципів генетичного контролю синтезу полікетидів та явищі широкої субстратно!' специ­ фічності ферментів вторинного метаболізму. Експерименти зі створення штучних шляхів біосинтезу полікетидних антибіотиків показали, що сучасний рівень розуміння механізмів функціону­ вання ПКС II типу не є вичерпним, оскільки не завжди дозволяє передбачити структуру продуктів експресії цих П К С Маніпуляції з генами ПКС І типу дозволяють створювати складні макролідні сполуки з передбачуваною структурою. Рівень про­ дукції «гібридних» макролідів є інколи надто низь­ ким для впровадження штамів-продуцентів у про­ мисловість. Цей факт свідчить про існування пев­ них невивчених особливостей у функціонуванні і взаємодії доменів та модулів в рекомбінантних синтазах, регуляції експресії генів рекомбінантних ПКС І типу. Тому подальше вивчення біосинтезу полікетидних антибіотиків, як і пошук нових при­ родних полікетидів, надалі залишається актуаль­ ним [33, 56]. Разом з тим успіхи в конструюванні проду­ центів нових біологічно активних речовин (епіру- біцину, 6-гідроксіаклациноміцину, тетраценоміци­ ну М, урдаміцину J тощо) та в створенні «мак- ролідних бібліотек» (рекомбінантних ery-ПКС), а також можливість отримання принципово нових сполук (TW93h) і розширення субстратної спе­ цифічності окремих ферментів вторинного мета­ болізму за допомогою маніпуляцій з їхніми генами in vitro [28 ] свідчать про перспективність викори­ стання методів генетичної інженерії для генеруван­ ня нових біологічно активних полікетидних сполук. В. О. Ostash, V. О. Fedorenko Gene engineering of novel polyketide antibiotics producers Summary Current understanding of the polyketide antibiotics synthesis is reviewed. Detailed heuristics in both genetic and biochemical aspects of polyketide synthesis allows to create the recombinant strains — producers of new polyketides with predicted structure. Methods for rational genetic *design» of hybrid compounds are described and examples of engineered synthesis of the industrially important polyketide antibiotics are given. Б. E. Осташ, В. А Федоренко Создание продуцентов новых поликетидных антибиотиков с помощью методов генетической инженерии Резюме Сделан обзор современных экспериментальных данных в обла­ сти исследований биосинтеза поликетидов — одной из наиболь­ ших групп природных соединений, проявляющих ряд ценных биологических свойств. Понимание генетических и биохимиче­ ских аспектов поликетидного синтеза позволяет создавать рекомбинантные штаммы микроорганизмов, продуцирующие соединения с заданной структурой. Описаны основные методы генетического «дизайна» новых поликетидных соединений, при­ ведены примеры геноинженерного конструирования продуцен­ тов промышленно важных поликетидных антибиотиков. 475 ОСТАШ Б. О., ФЕДОРЕНКО В. О. ПЕРЕЛІК ЛІТЕРАТУРИ l.Pfeifer В. A., Khosla С. Biosynthesis of polyketides in heterologous hosts / / Microbiol, and Мої. Biol. Rev.—2001.— 65.—P. 106—118. 2. Hutchinson C. R., Fujii I. Polyketide synthase gene manipula­ tion: a structure-function approach in engineering novel an­ tibiotics / / Annu. Rev. Microbiol.—1995.—49.—P. 201—238. 3. Hagan D. O. Biosynthesis of fatty acid and polyketide metabolites / / Nat. Prod. Rep.—1995.—10.—P. 1—31. 4. Krohn K, Rohr / . Angucyclines: total syntheses, new structures and biosynthetic studies of an emerging new class of antibiotics / / Top. Curr. Chem.—1997.—188.—P. 127—195. 5. Hwang С. K, Kim H. S.t Hong Y.S., Кіт У.-Я., Hong S.-Kf Kim S.-J.t Lee J. S. Expression of Streptomyces peucetius genes for doxorubicin resistance and aklavinone hydroxylase in Streptomyces galilaeus ATCC31133 and production of a hybrid aclacinomycin / / Antimicrob. Agents Chemother.— 1995.—39, N 7.—P. 1616—1620. 6. Kramer P. J., Zawada R. J. X.t McDaniel R.f Hutchinson C. R., Hopwood D. A., Khosla C. Rational design and engineered biosynthesis of a novel 18-carbon aromatic polyketide / / J. Amer. Chem. Soc.—1997.—119, N 4.—P. 636—639. 7. Lewis K. Multidrug resistance pumps in bacteria: variations on a theme / / TIBS Lett.—1994.—34.—P. 119—124. 8. Thiericke R.f Rohr J. Angucycline group antibiotics / / Nat. Prod. Rep.—1993.—9.—P. 103—137. 9. Bisang C , Long P. F.t Cortes /., Westcott /., Crosby /., Matharu A.-L, Cox R. /., Simpson T. /., Staunton J., Leadlay P. F. A chain initiation factor common to both modular and aromatic polyketide synthases / / Nature.—1999.—401.— P. 502—505. 10. Hopwood D. A. Forty years of genetics with Streptomyces: from in vivo through in vitro to in silico II Microbiology.— 1999.—145.—P. 2183—2202. 11. Staunton Wilkinson B. Biosynthesis of erythromycin and rapamycin / / Chem. Rev.—1997.—97.—P. 2611—2629. 12. Rangan V. S., Joshi A. K, Smith S. Mapping the functional topology of the animal fatty acid synthase by mutant com­ plementation in vitro II Biochemistry.—2001.—40, N 36.— P. 10792—10799. 13. Hopwood D. A. Genetic contributions to understanding poly­ ketide synthase / / Chem. Rev.—1997.—97.—P. 2465—2497. 14. Hutchinson C. R., Decker H., Tang L. Genetic control of polyketide synthesis in the genus Streptomyces II Antonie van Leeuwenhoek Lect.—1993.—64.—P. 165—176. 15. Funa M, Ohnishi Y., Fujii /., Shibuya M.t Ebizuka Y., Hourinouchi S. A new pathway for polyketide synthesis in microorganisms / / Nature.—1999.—400.—P. 897—899. 16. Wu N., Tsuji S. Y., Cane D. E., Khosla C. Assessing the balance between protein-protein interactions and enzymersub- strate interactions in the channeling of intermediates between polyketide synthase modules / / J. Amer. Chem. Soc.—2001.— 123, N 27.—P. 6465—6474. 17. Gokhale R. S.t Tsuji S. Y„ Cane D. E, Khosla C. Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide syn­ thase / / Science.—1999.—284.—P. 482—485. 18. Tsuji S. Y.t Wu N.t Khosla C. Intermodular communication in polyketide synthases: comparing the role of protein-protein interactions to those in other multidomain proteins / / Bio­ chemistry.—2001.—40, N 8.—P. 2317—2325. 19. Gaisser S.t Bohm G. A., Cortes Leadlay Я. F. Analysis of a seven genes from the eryAl-eryK region off the erythromycin biosynyhetic cluster in Saccharopolyspora erythraea II Мої. and Gen. Genet.—1997.—256.—P. 239—251. 20. Salah-Bey K, Doumith M.t Haydock S.t Cortes J., Leadlay P. F, Raynal Л/. Targeted gene inactivation for the elucidation of deoxysugar biosynthesis in the erythromycin producer Sac­ charopolyspora erythraea II Мої. and Gen. Genet.—1998.— 257.—P. 542—553. 21. SuwaM., SuginoH, SasaokaA., Mori E., Fujii S., Shinkawa #., Nimi O., Kinashi H. Identification of two polyketide synthase gene clusters on the linear plasmid pSLA2-L in Streptomyces rochei II Gene.—2000.—246, N 1—2.— P. 123—131. 22. Kwon H.-J.t Smith W. C , Xiang L, Shen B. Cloning and heterologous expression of the macrotetrolide biosynthetic gene cluster revealed a novel polyketide synthase that lacks an acyl carrier protein / / J. Amer. Chem. Soc—2001.—123, N 14.— P. 3385—3386. 23. Yu T. W., Shen Y, Doi-Katayama Y, Tang L, Park C , Moore B. S., Hutchinson C. R., Floss H. G. Direct evidence that the rifamycin polyketide synthase assembles polyketide chains processively / / Biochemistry.—1999.—96, N 16.— P. 9051—9056. 24. Brautaset Т., Sekurova O., Sletta #., Ellingsen T. N., Stromm A. R.f Valla S., Zotchev S. B. Biosynthesis of the polyene antifungal antibiotic nystatin in Streptomyces noursei ATCC 11455: analysis of the cluster and deduction of the biosynthesis pathway / / Chem. Biol.—2000.—7.—P. 395—403. 25. Pfeifer A., Admiraal S. Gramajo #., Cane D. E.t Khosla C. Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain Escherichia coli II Science.—2001.—291.— P. 1790—1792. 26. Tsoi C. / . , Khosla C. Combinatorial biosynthesis of «un- natural* natural products: the polyketide example / / Chem. and Biol.—1995.—2.—P. 355—362. 27. Hutchinson C. R. Microbial polyketide synthase: more and more proline / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA—1999.—96, N 5.—P. 3336—3338. 28. Khosla C , Gokhale R. S., Jacobsen /. R., Cane D. E. Tolerance and specificity of polyketide synthases / / Ann. Rev. Biochem.—1999.—68.—P. 219—253. 29. Shen В., Hutchinson С. Л. Deciphering the mechanism for the assembly of aromatic polyketides by a bacterial polyketide synthase / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA—1996.—63.— P. 6600—6604. 30. Shen В., Summers R. G., Wendt-Pienkowski E. The Strep­ tomyces glaucescens tcmKL polyketide synthase and tcmN polyketide cyclase genes govern the size and shape of the aromatic antibiotics / / J. Amer. Chem. Soc—1995.—117.— P. 6811—6821. 31. Bao W., Sheldon P. /., Wendt-Pienkowski E.t Hutchinson C. R. The Streptomyces peucetius dpsC gene determines the choice of starter unit in biosynthesis of daunorubicin polyketide / / J. Bacterid.—1999.—181, N 15.—P. 4690—4695. 32. Zawada R. /. X., Khosla C. Domain analysis of the molecular features of aromatic polyketide synthase subunits / / J. Biol. Chem.—1997.—272, N 26.—P. 16184—16188. 33. Dreier /., Khosla C. Mechanistic analysis of a type II polyketide synthase. Role of conserved residues in the ketoacyl synthase-chain length factor heterodimer / / Biochemistry.— 2000. -39 , N 8.—P. 2088—2095. 34. McDaniel R., Khosla S.-E., Hopwood D. A, Khosla C. Rational design of aromatic polyketide natural products by recombinant assembly of enzymatic subunits / / Nature.— 1995.—375.—P. 549—554. 35. Meurer G., Gerlitz M., Wendt-Pienkowski E., Vining L C , Rohr J., Hutchinson C. R. Iterative type II polyketide syn­ thases, cyclases and ketoreductases exhibit context-dependent behavior in the biosynthesis linear and angular decapolyketides / / Chem. and Biol.—1997.—4, N 6—P. 433—443. 36. McDaniel R. Engineered biosynthesis of novel polyketides: 476 СТВОРЕННЯ ПРОДУЦЕНТІВ НОВИХ ПОЛІКЕТИДНИХ АНТИБІОТИКІВ analysis of TcmN function in tetracenomycin biosynthesis / / J. Amer. Chem. Soc.—1995.—117.—P. 6805—6810. 37. Hutchinson C. R. Biosynthetic studies of daunorubicin and tetracenomycin / / Chem. Rev.—1997.—97.—P. 2525—2535. 38. Bentley R., Bennett J. W. Constructing polyketides: from Collie to combinatorial biosynthesis / / Annu. Rev. Microbiol.— 1999.—53.—P. 411—446. 39. Ostash В. O., Pankevych fC O., Luzhetskiy A. M., Basiliya L. I., Gromyko О. M., Kruegel #., Fedorenko V. O. Studying of genes involved in landomycin E biosynthesis by Streptomyces globisporus 1912 / / 12 t h Int. Symp. on Biol, of Actino- mycete.—Vancouver, 2001.—P. 133. 40. McDaniel R., Gustafsson C , Fu #., Betlach M.t Ashley G. Multiple genetic modifications of the erythromycin polyketide synthase to produce a library of novel «unnatural» natural products / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA—1999.—96D.— P. 1846—1851. 41. Hurtweck C. The multiplasmid approach: a new perspective for combinatorial biosynthesis / / Chembiochemistry.—2000.— 1.—P. 103—106. 42. Tang L, McDaniel R. Construction of desosamine containing polyketide libraries using a glycosyltransferase with broad substrate specificity / / Chem. and Biol.—2001.—8, N 6.— P. 547—555. 43. Shen Y, Yoon P., Yu T.-W.t Floss #., Hopwood D. A., Moore B. Ectopic expression of the minimal whiE polyketide synthase generates a library of aromatic polyketides of diverse sizes and shapes / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA—1999.—96, N 5,— P. 3622—3627. 44. Fernandez-Moreno M. A., Carbo L., Cuesta T.r Vallin C , Malpartida F. A silent ABC-transporter isolated from Strep­ tomyces rochei F20 induces multidrug resistance III. Bac- teriol.—1998.—180, N 16.—P. 4017—4023. 45. Kunzel E., Wohlert S.-E., Beninga C , Haag S.f Decker #., Hutchinson C. R., Blanca G., Mendez C , Salas /. A., Rohr J. Tetracenomycin M, a novel genetical engineered tetra­ cenomycin resulting from a combination of mithramycin and tetracenomycin biosynthetic genes / / Chem. Eur. J.—1997.— 3, N 10.—P. 1675—1678. 46. Kirsching A., Bechthold A., Rohr J. Chemical and biochemical aspects of deoxysugars and deoxysugar oligosaccharides / / Top. Curr. Chem.—1997.—188.—P. 1—84. 47. Salas J. A., Mendez C. Genetic manipulation of antitumor- agent biosynthesis to produce novel drugs / / TIBTECH.— 1998.—161, N 16.—P. 475—482. 48. Niemi J. Hybrid anthracycline antibiotics production of an- thracyclines by cloned genes from S. purpurascens in S. galilaeus II Microbiology.—1994.—140.—P. 1351 — 1358. 49. Betlach Mary C , Kealey J. Т., Betlach Melanie C , Ashley G. W., McDaniel R. Characterization of the macrolide P-450 hydroxylase from Streptomyces venezulae which converts nar- bomycin to picromycin / / Biochemistry.—1998.—37.— P. 14937—14942. 50. Brukner P., Sterner O., Bailey J. E., Minos W. Production of novel hybrid polyketides by heterologous expression of the naphtocyclinone aromatase and hydroxylase genes from Strep­ tomyces arenae II Proc. of the 11 t h Int. Symp. on Biol, of Actinomycetes (Crete-Greece, October 24—28 1999).—Sissi- Heraklion, 1999.—P. 85. 51. Kantola J., Kunnari Т., Hautala A., Hakala J., Ylihonko K., Mantsala P. Elucidation of anthracyclinone biosynthesis by stepwise cloning of genes for anthracyclines from three dif­ ferent Streptomyces spp. II Microbiology.—2000.—146.— P. 155—163. 52. Quiros JL M.t Carbajo R. /., Brana A. F.t Solas J. A. Glycosylation of macrolide antibiotics. Purification and kinetic studies of a macrolide glycosyltransferase from Sreptomyces antibioticus II J. Biol. Chem.—2000.—275, N 16.— P. 11713—11720. 53. Gaisser S., Doumith M.t Olano C. In vivo expression of glycosyltransferases in Saccharopolyspora erythraea II Proc. of the 11 t h Int. Symp. on Biol, of Actinomycetes (Crete- Greece, October 24—28 1999).—Sissi-Heraklion, 1999.— P. 186. 54. Gaisser S., Leadlay P. F. Sugaring the pill by design / / Nat. Biotech.—1998.—16.—P. 1—4. 55. Patallo E. P., Blanco G.t Fischer C, Brana A., Rohr J., Mendez C , Salas J. A. Deoxysugar methylation during biosynthesis of the antitumor polyketide elloramycin by Strep­ tomyces olivaceus. Characterizaion of three methyltransferase genes / / J. Biol. Chem.—2001.—276, N 22.—P. 18765— 18774. 56. Федоренко В. О., Басілія Л. І., Панькевич К. О., Дубицька Л. П., Осташ Б. О., Лужецький А. М., Громико О. М.у Крюгель Г. Генетичний контроль біосинтезу актиномі­ цетами протиракових антибіотиків-полікетидів / / Бюл. Ін-ту с.-г. мікробіології.—2000.—8.—С. 27—31. УДК 576.8.095.382 Надійшла до редакції 09.07.01 477

Similar Items