Аналіз трансгенних рослин кукурудзи та соняшнику з підвищеним рівнем стійкості до водного стресу

Aims. The trustworthy selection of transgenic plants essentially makes fast the whole transformation of procedure. The optimization of mass screening of corn and sunflower plants, obtained after Agrobacterium – mediated transformation in planta was created. Methods. Agrobacterium – mediated transfor...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2015
Hauptverfasser:	Комісаренко, А.Г., Михальська, С.І., Курчій, В.М., Сергєєва, Л.Є.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainian
Veröffentlicht:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2015
Schriftenreihe:	Фактори експериментальної еволюції організмів
Schlagworte:	Молекулярні та клітинні біотехнології
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177490
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Аналіз трансгенних рослин кукурудзи та соняшнику з підвищеним рівнем стійкості до водного стресу / А.Г. Комісаренко, С.І. Михальська, В.М. Курчій, Л.Є. Сергєєва // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2015. — Т. 16. — С. 189-192. — Бібліогр.: 13 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-177490
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1774902025-02-09T21:36:26Z Аналіз трансгенних рослин кукурудзи та соняшнику з підвищеним рівнем стійкості до водного стресу The analysis of transgenic corn and sunflower plants levels resistance to water stress Комісаренко, А.Г. Михальська, С.І. Курчій, В.М. Сергєєва, Л.Є. Молекулярні та клітинні біотехнології Aims. The trustworthy selection of transgenic plants essentially makes fast the whole transformation of procedure. The optimization of mass screening of corn and sunflower plants, obtained after Agrobacterium – mediated transformation in planta was created. Methods. Agrobacterium – mediated transformation with pBi2E suppressor of proline dehydrogenase gene was carried out. T0 corn and sunflower plants were tested under stress pressure. Lethal water stress in vitro was simulated by the addition of mannitol. The levels of free proline were measured. Results. The transgenic forms survived under lethal water stress. The free proline levels increased in plant tissues in various manners. The free proline contents maintained the tolerance and viability of transformed plants. Conclusions. The reliable method of the detection of plants, resistant to water stress there were proposed. 2015 Article Аналіз трансгенних рослин кукурудзи та соняшнику з підвищеним рівнем стійкості до водного стресу / А.Г. Комісаренко, С.І. Михальська, В.М. Курчій, Л.Є. Сергєєва // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2015. — Т. 16. — С. 189-192. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. 2219-3782 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177490 577.21: 579.254.2: 581.143.5 uk Фактори експериментальної еволюції організмів application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Молекулярні та клітинні біотехнології Молекулярні та клітинні біотехнології
spellingShingle	Молекулярні та клітинні біотехнології Молекулярні та клітинні біотехнології Комісаренко, А.Г. Михальська, С.І. Курчій, В.М. Сергєєва, Л.Є. Аналіз трансгенних рослин кукурудзи та соняшнику з підвищеним рівнем стійкості до водного стресу Фактори експериментальної еволюції організмів
description	Aims. The trustworthy selection of transgenic plants essentially makes fast the whole transformation of procedure. The optimization of mass screening of corn and sunflower plants, obtained after Agrobacterium – mediated transformation in planta was created. Methods. Agrobacterium – mediated transformation with pBi2E suppressor of proline dehydrogenase gene was carried out. T0 corn and sunflower plants were tested under stress pressure. Lethal water stress in vitro was simulated by the addition of mannitol. The levels of free proline were measured. Results. The transgenic forms survived under lethal water stress. The free proline levels increased in plant tissues in various manners. The free proline contents maintained the tolerance and viability of transformed plants. Conclusions. The reliable method of the detection of plants, resistant to water stress there were proposed.
format	Article
author	Комісаренко, А.Г. Михальська, С.І. Курчій, В.М. Сергєєва, Л.Є.
author_facet	Комісаренко, А.Г. Михальська, С.І. Курчій, В.М. Сергєєва, Л.Є.
author_sort	Комісаренко, А.Г.
title	Аналіз трансгенних рослин кукурудзи та соняшнику з підвищеним рівнем стійкості до водного стресу
title_short	Аналіз трансгенних рослин кукурудзи та соняшнику з підвищеним рівнем стійкості до водного стресу
title_full	Аналіз трансгенних рослин кукурудзи та соняшнику з підвищеним рівнем стійкості до водного стресу
title_fullStr	Аналіз трансгенних рослин кукурудзи та соняшнику з підвищеним рівнем стійкості до водного стресу
title_full_unstemmed	Аналіз трансгенних рослин кукурудзи та соняшнику з підвищеним рівнем стійкості до водного стресу
title_sort	аналіз трансгенних рослин кукурудзи та соняшнику з підвищеним рівнем стійкості до водного стресу
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	2015
topic_facet	Молекулярні та клітинні біотехнології
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/177490
citation_txt	Аналіз трансгенних рослин кукурудзи та соняшнику з підвищеним рівнем стійкості до водного стресу / А.Г. Комісаренко, С.І. Михальська, В.М. Курчій, Л.Є. Сергєєва // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. — 2015. — Т. 16. — С. 189-192. — Бібліогр.: 13 назв. — укр.
series	Фактори експериментальної еволюції організмів
work_keys_str_mv	AT komísarenkoag analíztransgennihroslinkukurudzitasonâšnikuzpídviŝenimrívnemstíikostídovodnogostresu AT mihalʹsʹkasí analíztransgennihroslinkukurudzitasonâšnikuzpídviŝenimrívnemstíikostídovodnogostresu AT kurčíivm analíztransgennihroslinkukurudzitasonâšnikuzpídviŝenimrívnemstíikostídovodnogostresu AT sergêêvalê analíztransgennihroslinkukurudzitasonâšnikuzpídviŝenimrívnemstíikostídovodnogostresu AT komísarenkoag theanalysisoftransgeniccornandsunflowerplantslevelsresistancetowaterstress AT mihalʹsʹkasí theanalysisoftransgeniccornandsunflowerplantslevelsresistancetowaterstress AT kurčíivm theanalysisoftransgeniccornandsunflowerplantslevelsresistancetowaterstress AT sergêêvalê theanalysisoftransgeniccornandsunflowerplantslevelsresistancetowaterstress
first_indexed	2025-12-01T01:30:10Z
last_indexed	2025-12-01T01:30:10Z
_version_	1850267520286588928
fulltext	ISSN 2219-3782. Фактори експериментальної еволюції організмів. 2015. Том 17 189 © Аналіз трансгенних рослин кукурудзи та соняшнику з підвищеним рівнем стійкості до водного стресу К ом іс ар ен ко А .Г ., М их ал ьс ьк а С .І. , К ур чі й В .М ., С ер гє єв а Л .Є . Результати досліджень генетичної транс- формації ряду видів однодольних та дводольних рослин показали, що трудомісткі та економічно затратні процедури культивування in vitro мож- на замінити на Agrobacterium-опосередковану транс формацію in planta [1–4]. Метод Agrobacterium – опосередкованої трансформації in planta полягає у перенесенні в генеративні клітини та інтеграції в геном реципі- єнтних рослин векторних конструкцій з подаль- шим скринінгом значної кількості отриманих ва- ріантів для виділення форм з новими бажаними характеристиками. загалом метод передбачає ви- користання векторних конструкцій, до складу яких входять цільовий ген (ген інте ресу) і мар- керний (селективний) ген. Після здійснення про- цедури трансформації та отримання поколін- ня Т0 відбір індивідуальних трансформованих рослин у загальному масиві Т0 проводять в два етапи [5]. Першим етапом є селекція за маркер- ним геном (ознакою). здебільшого – це гени npt II, gus тощо. На другому етапі ведуть тестуван- ня експресії цільової ознаки у варіантів, відібра- них на першому етапі. застосування конструк- ції із маркерними генами подовжує алгоритм від- бору нових форм, з однієї сторони, та посилює негативний тиск на довкілля, з другої. Тому ос- таннім часом починають залучати до генетич- ної транс формації конструкції лише з цільовим геном, а тестування здійснюють, створюючи мо- дельні системи добору. Так, наприклад, застосо- вуючи конструкцію, яка сприяла акумуляції віль- ного проліну, трансгенні форми відбирались in vitro на середовищі із додаванням 200 мМ NaCl [6]. В іншому випадку при використанні конст- рукції, яка викликала підвищення рівня пролі- ну в наслідок репресії ферменту катаболізму цієї амінокислоти, трансгенні форми відбирались на середовищі із додаванням 250 мМ NaCl [7]. за- стосовуються інші підходи: зокрема трансгенні © КОМІСАРЕНКО А.Г., МИХАЛьСьКА С.І., КУРЧІЙ В.М., СЕРГЄЄВА Л.Є. форми арабідопсису виділяли, обприскуючи рос- лини 100 мМ розчином NaCl [8]. Головним недоліком селекції без викори- стання антибіотика безпосередньо на стресовому фоні, може бути неадекватна концентрація стре- сору. У випадку Agrobacterium – опосередкова- ної трансформації in vitro, коли отримується не- значна кількість регенерантів, можливий індиві- дуальний аналіз і підбір селективної концентра- ції стресового чинника для кожного регенеранта. Однак при трансформації in planta, спрямованої на масове отримання покоління Т0, тільки вико- ристання жорстких умов селекції може гаранту- вати добір форм з бажаними характеристиками . Метою нашої роботи було удосконалення та спрощення процедури добору трансгенних рос- лин з підвищеним рівнем стійкості до водного дефіциту, отриманих при Agrobacterium – опосе- редкованій трансформації in planta. Матеріали і методи Agrobacterium-опосередковану трансформа- цію planta кукурудзи генотипу Л-370 та соняш- нику – VK-121 проводили згідно методики опи- саної раніше [9, 10]. Для трансформації використовували штам Agrobacterium tumifaciens LBA 4404, що вклю- чав векторну конструкцію pBi2E із цільовим ге- ном – дволанцюговим РНК супресором гена про- ліндегідрогенази (ProDH) та селективним геном неоміцинфосфотрансферази (nptII). Конструкція люб’язно надана к.б.н. Кочетовим А.В. (Інсти- тут цитології і генетики Сибірського відділення РАН, м. Новосибірськ). Нові рослинні форми виділяли в умовах дії модельованого водного стресу in vitro. Для ство- рення системи добору визначали селективну (ле- тальну) концентрацію маніту, яка і для кукурудзи і для соняшнику становила 0,8 М. Маніт є неме- таболізованим вуглеводом, який моделює водний дефіцит. УДК 577.21: 579.254.2: 581.143.5 КОМІСАРЕНКО А.Г., МИХАЛьСьКА С.І., КУРЧІй В.М., СЕРГЄЄВА Л.Є. Інститут фізіології рослин і генетики НАН Украіни, Україна, 03022, м. Київ, вул. Васильківська, 31/17, e-mail: svetlana_mykhalska@mail.ru АНАЛІЗ ТРАНСГЕННИХ РОСЛИН КУКУРУДЗИ ТА СОНЯШНИКУ З ПІДВИЩЕНИМ РІВНЕМ СТІйКОСТІ ДО ВОДНОГО СТРЕСУ 190 ISSN 2219-3782. Фактори експериментальної еволюції організмів. 2015. Том 17 Комісаренко А.Г., Михальська С.І., Курчій В.М., Сергєєва Л.Є. досліджень представлені дані, що свідчать про позитивну кореляцію між вмістом проліну та стійкістю рослин [12]. Стосовно гена ProDH, то його значення в біотехнологіях по підвищен- ню стрес-стійкості тільки досліджується. Тому для аналізу ефективності проведеної процеду- ри трансформації та для відбору рослин з підви- щеним рівнем стійкості встановлювали летальні концентрації маніту. Для обох культур вона ста- новила 0,8 М (рис. 1, 2). У відібраних трансформантів впродовж культивування вимірювали вміст проліну, який за нормальних умов у тканинах різних рослин варіював у широких межах, проте за абсолют- ною величиною не перевищував 20,56 ± 2,04 мг % / сиру масу. за дії водного стресу вміст пролі- ну зростав (рис. 3). Флуктуації рівня проліну – це звичайне яви- ще, яке може бути обумовлене фізіологічним ста- тусом тканин, віком рослини, часом проведення Рівень проліну у стійких до стресового чин- ника варіантів визначали згідно методики Чинар- да [11], молекулярно-генетичний аналіз їх ДНК на наявність трансгенів перевіряли методом ПЛР, як описано нами раніше [9]. Результати та обговорення У разі аналізу значної кількості варіантів Т0, наприклад зернівок у колосі, початку або сім’я- нок у кошику, головним аспектом є встановлення концентрацій стресового чинника, яка дозволить гарантовано відібрати трансгенні варіанти. Вико- ристання летальних доз стресора викликає заги- бель контрольних варіантів (нетрансформованих і трансформованих, в яких не експресується ген, що забезпечує стійкість). У наших дослідженнях для трансформа- ції кукурудзи та соняшнику використовували длРНК-супресор гена проліндегідрогенази арабі- допсису, експресія якого передбачала збільшен- ня рівня проліну і як результат підвищення рів- ня стрес-стійкості трансгенних рослин. У ряді 1 етап 2 етап Рис. 1. Визначення селективної концентрації маніту для добору трансформантів соняшнику (1 етап – 0,5 М; 2 етап – 0,8 М) Рис. 2. Відбір трансформантів кукурудзи в умовах дії селективної (летальної) концентрації маніту Рис. 3. Вміст вільного проліну у рослинах соняшни- ку і кукурудзи на 21-у добу дії модельованого вод- ного стресу ISSN 2219-3782. Фактори експериментальної еволюції організмів. 2015. Том 17 191 Аналіз трансгенних рослин кукурудзи та соняшнику з підвищеним рівнем стійкості до водного стресу Висновки Таким чином, нами запропонована систе- ма масового скринінгу та відбору осмостійких транс формантів кукурудзи та соняшнику з вико- ристанням летальної для звичайних рослин дози маніту. Відібрані варіанти характеризувались під- вищеним рівнем проліну та наявністю цільово- го гена. вимірювання [12]. Як видно з рисунку 3 транс- форманти кукурудзи та соняшнику мали різ- ний (за абсолютною величиною) вміст вільного проліну, але всі вони відзначались стрес-стійкі- стю. На нашу думку таким чином підтримував- ся оптимальний рівень амінокислоти, який забез- печував життєдіяльність. Відомо, що надлишко- ві кількості проліну можуть перешкоджати нор- мальному росту і розвитку [13]. Тобто, за умов модельованого летального водного стресу від- бувалось збереження нативних структур для по- дальшого розвитку. Відібрані рослини Т0, які відзначалися підвищеним рівнем проліну при культивуванні за умов довготривалого модельо- ваного осмотичного стресу були перенесені в по- льові умови. ДНК таких рослин піддавали моле- кулярно-генетичному аналізу (рис. 4). Проведений ПЛР-аналіз із використанням праймерів до першого екзону та інтрону дволан- цюгового РНК-супрессора гена проліндегідроге- нази 1 арабідопсиса показав наявність цільового гена у тотальній ДНК листків стійких до леталь- них концентрацій маніту рослин. Рис. 4. Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК соняшнику: № 1, 2, 4–7 – ДНК трансформантів соняшнику, відібраних на середовищі з летальною концентрацією маніту; № 3 – ДНК не трансгенної рослини соняшнику; №8 – позитивний контроль; № 9 – негативний контроль; М – маркер молекуляр- ної маси Generuler™ DNa Ladder Mix, Fermentas ЛІТЕРАТУРА 1. Bent a.F. arabidopsis in Planta Transformation. Uses, Mechanisms, and Prospects for Transformation of Other Species // Plant Physiology. – 2000. – 124. – P. 1540–1547. 2. Wang J., Sun Y., Li Y. Maize (Zea mays) genetic transformation by co-cultivating germinating seeds with Agrobacterium tumefaciens // Biotechnol appl. Biochem. – 2007. – 46, (Pt 1). – P. 51–55. 3. Wang M., Zhang B., Wang Q. Cotton transformation via pollen tube pathway // Methods Mol. Biol. – 2013. – 958. – P. 71–77. 4. Чумаков М.И., Рожок Н.А., Великов В.А. и др. Трансформация кукурузы путем инокуляции агробактериями пестичных нитей in planta // Генетика. – 2006. – 42, № 8. – С. 1083–1088. 5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер.с англ. – М.: Мир, 1984. – 480 с. 6. Патент № 2324737, Российская Федерация, МПК С12N015/82 «Способ получения трансгенных растений табака с повышен- ным содержанием пролина» / С.Е. Титов, А.В. Кочетов, Я.С. Колодяжная и др.; заявитель и патентообладатель Институт ци- тологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (СО РАН) – № 2006136956/13; заявл. 18.10.2006; опубл. 20.05.2008. 7. Патент № 2324736, Российская Федерация, МПК С12N015/82 «Способ получения трансгенных растений табака с повышен- ным содержанием пролина» / С.Е. Титов, С.В. Герасимова, А.В. Кочетов и др.; заявитель и патентообладатель Институт ци- тологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (СО РАН) – № 2006136954/13; заявл. 18.10.2006; опубл. 20.05.2008. 8. Патент № 2350653, Российская Федерация, МПК C12N5/14, C12N15/82, C12N15/29 «Способы повышения толерантности к абиотическому стрессу и/или биомассы у растений и получаемые таким образом растения» Карчи Х., Мейсснер Р., Ронен Д., Голан Е.; заявитель и патентообладатель Эводжин ЛТД; - № 2005140106/13 9. Тищенко Е.Н., Комисаренко А.Г., Михальская С.И., Сергеева Л.Е., Адаменко Н.И., Моргун Б.В., Кочетов А.В. Agrobacterium-опо- средованная трансформация подсолнечника (Helianthus Annuus L.) in vitro и in planta с использованием штамма LBa4404, не- сущего плазмиду pBI2E с двухцепочечным РНК-супрессором гена пролиндегидрогеназы // Цитология и генетика. – 2014. – 48, № 4. – С. 19–30. 192 ISSN 2219-3782. Фактори експериментальної еволюції організмів. 2015. Том 17 Комісаренко А.Г., Михальська С.І., Курчій В.М., Сергєєва Л.Є. 10. Михальская С.И., Сергеева Л.Е., Матвеева А.Ю., Коберник Н.И., Кочетов А.В., Тищенко Е.Н., Моргун В.В. Повышение содержания свободного пролина в осмотолерантных растениях кукурузы с двухцепочечным РНК-супресором гена пролин- дегидрогеназы // Физиология растений и генетика. – 2014. – 46, № 6. – С. 482–489. 11. Андрющенко В.К., Саянова В.В., Жученко А.А. и др. Модификация метода определения пролина для выявления засухоустой- чивых форм рода Lycopersicon Tourn // Известия Академии Наук Молдавской ССР. – 1981, № 4. – С. 55–60. 12. Szabados L., Savoure a. Proline: a multifunctional amino acid // Trends Plant Sci. – 2010 – 15 – P. 89–97. 13. Nanjo T., Fujita M., Seki M., Kato T., Tabata S., Shinozaki K. Toxicity of proline revealed in an Arabidopsis T-DNa-tagged mutant deficient in proline dehydrogenase // Plant Cell Physiol. – 2003. – 44. – P. 541–548. KOMISARENKO A.G., MYKHALSKA S.I., KURCHII V.M., SERGEEVA L.E. Institute of Plant Physiology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Ukraine, 03022, Kyiv, Vasylkivska str., 31/17, e-mail: svetlana_mykhalska@mail.ru THE ANALYSIS OF TRANSGENIC CORN AND SUNFLOWER PLANTS LEVELS RESISTANCE TO WATER STRESS Aims. The trustworthy selection of transgenic plants essentially makes fast the whole transformation of procedure. The optimization of mass screening of corn and sunflower plants, obtained after Agrobacterium – mediated transformation in planta was created. Methods. Agrobacterium – mediated transformation with pBi2E suppressor of proline dehydrogenase gene was carried out. T0 corn and sunflower plants were tested under stress pressure. Lethal water stress in vitro was simulated by the addition of mannitol. The levels of free proline were measured. Results. The transgenic forms survived under lethal water stress. The free proline levels increased in plant tissues in various manners. The free proline contents maintained the tolerance and viability of transformed plants. Conclusions. The reliable method of the detection of plants, resistant to water stress there were proposed. Keywords: Zea mays, Helianthus annuus, Agrobacterium – mediated transformation in planta, proline dehydrogenase gene suppressor, water stress, resistance.

Аналіз трансгенних рослин кукурудзи та соняшнику з підвищеним рівнем стійкості до водного стресу

Institution

Ähnliche Einträge