Сайтспецифічна ендонуклеазна активність нитчастої ціанобактерії Plectonema boryanum
З нитчастої ціанобактерії Plectonema boryanum CALU 465 виділено сайтспецифічну ендонуклеазу PboI. Фермент отримано послідовною хроматографією на колонках з DEAE-Toyopearl, фосфоцелюлозою і блакитною сефарозою. Дана ендонуклеаза рестрикції, подібно до Bam HI, впізнає та розщеплює паліндромну послідов...
Saved in:
| Date: | 2011 |
|---|---|
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2011
|
| Series: | Доповіді НАН України |
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/38566 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Сайтспецифічна ендонуклеазна активність нитчастої ціанобактерії Plectonema boryanum / Н.В. Цимбал, В.А. Самойленко, Ф. I. Товкач // Доп. НАН України. — 2011. — № 8. — С. 146-149. — Бібліогр.: 7 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-38566 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-385662025-02-23T20:25:07Z Сайтспецифічна ендонуклеазна активність нитчастої ціанобактерії Plectonema boryanum Site-specific endonuclease activity of filamentous cyanobacterium Plectonema boryanum Цимбал, Н.В. Самойленко, В.А. Товкач, Ф.І. Біологія З нитчастої ціанобактерії Plectonema boryanum CALU 465 виділено сайтспецифічну ендонуклеазу PboI. Фермент отримано послідовною хроматографією на колонках з DEAE-Toyopearl, фосфоцелюлозою і блакитною сефарозою. Дана ендонуклеаза рестрикції, подібно до Bam HI, впізнає та розщеплює паліндромну послідовність GGATCC. Фермент належить до II типу ендонуклеаз рестрикції. Оптимальна активність ферменту спостерігається при температурі 45 °С, pH 7,5, іонній силі 100 мМ. The site-specific endonuclease PboI was isolated from the filamentous cyanobacterium Plectonema boryanum. The purification included successive column chromatographies on DEAE-Toyopearl, phosphocellulose, and blue sepharose. Purified enzyme recognizes and cleaves GGATCC-palindrome sequence іs analogously to Bam HI. The enzyme belongs to type II restriction endonucleases. Thе enzyme activity is optimal at a temperature 45 °С, pH 7.5, and ionic strength 100 mM. 2011 Article Сайтспецифічна ендонуклеазна активність нитчастої ціанобактерії Plectonema boryanum / Н.В. Цимбал, В.А. Самойленко, Ф. I. Товкач // Доп. НАН України. — 2011. — № 8. — С. 146-149. — Бібліогр.: 7 назв. — укр. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/38566 577.:579.2 uk Доповіді НАН України application/pdf Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Біологія Біологія |
| spellingShingle |
Біологія Біологія Цимбал, Н.В. Самойленко, В.А. Товкач, Ф.І. Сайтспецифічна ендонуклеазна активність нитчастої ціанобактерії Plectonema boryanum Доповіді НАН України |
| description |
З нитчастої ціанобактерії Plectonema boryanum CALU 465 виділено сайтспецифічну ендонуклеазу PboI. Фермент отримано послідовною хроматографією на колонках з DEAE-Toyopearl, фосфоцелюлозою і блакитною сефарозою. Дана ендонуклеаза рестрикції, подібно до Bam HI, впізнає та розщеплює паліндромну послідовність GGATCC. Фермент належить до II типу ендонуклеаз рестрикції. Оптимальна активність ферменту спостерігається при температурі 45 °С, pH 7,5, іонній силі 100 мМ. |
| format |
Article |
| author |
Цимбал, Н.В. Самойленко, В.А. Товкач, Ф.І. |
| author_facet |
Цимбал, Н.В. Самойленко, В.А. Товкач, Ф.І. |
| author_sort |
Цимбал, Н.В. |
| title |
Сайтспецифічна ендонуклеазна активність нитчастої ціанобактерії Plectonema boryanum |
| title_short |
Сайтспецифічна ендонуклеазна активність нитчастої ціанобактерії Plectonema boryanum |
| title_full |
Сайтспецифічна ендонуклеазна активність нитчастої ціанобактерії Plectonema boryanum |
| title_fullStr |
Сайтспецифічна ендонуклеазна активність нитчастої ціанобактерії Plectonema boryanum |
| title_full_unstemmed |
Сайтспецифічна ендонуклеазна активність нитчастої ціанобактерії Plectonema boryanum |
| title_sort |
сайтспецифічна ендонуклеазна активність нитчастої ціанобактерії plectonema boryanum |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| publishDate |
2011 |
| topic_facet |
Біологія |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/38566 |
| citation_txt |
Сайтспецифічна ендонуклеазна активність нитчастої ціанобактерії Plectonema boryanum / Н.В. Цимбал, В.А. Самойленко, Ф. I. Товкач // Доп. НАН України. — 2011. — № 8. — С. 146-149. — Бібліогр.: 7 назв. — укр. |
| series |
Доповіді НАН України |
| work_keys_str_mv |
AT cimbalnv sajtspecifíčnaendonukleaznaaktivnístʹnitčastoícíanobakterííplectonemaboryanum AT samojlenkova sajtspecifíčnaendonukleaznaaktivnístʹnitčastoícíanobakterííplectonemaboryanum AT tovkačfí sajtspecifíčnaendonukleaznaaktivnístʹnitčastoícíanobakterííplectonemaboryanum AT cimbalnv sitespecificendonucleaseactivityoffilamentouscyanobacteriumplectonemaboryanum AT samojlenkova sitespecificendonucleaseactivityoffilamentouscyanobacteriumplectonemaboryanum AT tovkačfí sitespecificendonucleaseactivityoffilamentouscyanobacteriumplectonemaboryanum |
| first_indexed |
2025-11-25T05:29:41Z |
| last_indexed |
2025-11-25T05:29:41Z |
| _version_ |
1849739009007288320 |
| fulltext |
УДК 577.:579.2
© 2011
Н.В. Цимбал, В. А. Самойленко, Ф. I. Товкач
Сайтспецифiчна ендонуклеазна активнiсть нитчастої
цiанобактерiї Plectonema boryanum
(Представлено членом-кореспондентом НАН України I. Г. Скрипалем)
З нитчастої цiанобактерiї Plectonema boryanum CALU 465 видiлено сайтспецифiчну ен-
донуклеазу PboI. Фермент отримано послiдовною хроматографiєю на колонках з DEAE-
Toyopearl, фосфоцелюлозою i блакитною сефарозою. Дана ендонуклеаза рестрикцiї, по-
дiбно до Bam HI, впiзнає та розщеплює палiндромну послiдовнiсть GGATCC. Фермент
належить до II типу ендонуклеаз рестрикцiї. Оптимальна активнiсть ферменту спо-
стерiгається при температурi 45 ◦С, pH 7,5, iоннiй силi 100 мМ.
Система рестрикцiї–модифiкацiї ДНК є однiєю з характерних ознак прокарiотичних мiкро-
органiзмiв. Її призначення полягає в захистi господаря вiд вторгнення чужорiдної ДНК [1].
Вiдомо чотири типи систем рестрикцiї–модифiкацiї [2]. Найпоширенiший другий тип скла-
дається з двох ферментiв — рестриктази i метилази, якi дiють незалежно один вiд одного.
Рестриктази другого типу здатнi розпiзнавати палiндромнi послiдовностi ДНК i створюва-
ти розриви всерединi цих послiдовностей або на невеликiй вiдстанi вiд них з утворенням
ДНК-фрагментiв певної довжини. Така властивiсть рестриктаз та пов’язана з нею прос-
тота їх iдентифiкацiї дала можливiсть виявити близько 3,5 тисяч ферментiв, переважна
бiльшiсть яких має бактерiальне походження. Близько 200 таких ензимiв виявлено у цiа-
нобактерiй [3].
Метою наших дослiджень було видiлення та iдентифiкацiя ендонуклеази рестрикцiї нит-
частої негетероцистної цiанобактерiї Plectonema boryanuт. В експериментах використовува-
ли культуру P. boryanuт CALU 465, отриману з колекцiї Бiологiчного науково-дослiдного
iнституту Санкт-Петербурзького унiверситету [4]. Видiлення ферменту проводили з клiтин
культури, вирощеної в стерильних умовах на середовищi Фiтцджеральда при температурi
25–27 ◦С i освiтленнi 1200–1800 лк.
Вiдомо, що з клiтинною мембраною P. boryanum асоцiйована ендонуклеаза з неспеци-
фiчним характером дiї [5], яка ускладнює видiлення та iдентифiкацiю сайтспецифiчних
нуклеаз. Тому перед лiзисом клiтини тричi вiдмивали в буферi А (20 мМ трис-HCl, pH 8,0,
100 мМ NaCl, 10 мМ Na2ЕДТА, 0,1% Тритон X-100), що дозволило зменшити рiвень за-
гальної нуклеазної активностi не менш нiж на 75%. Вологi клiтини (1 г) ресуспендували
в буферi В (20 мМ трис-HCl, pH 8,0, 10 мМ Na2ЕДТА, 7 мМ 2-меркаптоетанолу, 1 мМ
фенiлметилсульфонiлфториду (ФМСФ)) i руйнували з використанням ультразвукового де-
зiнтегратора УЗДН-27. Лiзат клiтин освiтлювали шляхом центрифугування протягом 30 хв
з прискоренням 10000 g. Надосад використовували як джерело ендонуклеази рестрикцiї.
Хроматографiчне очищення ферменту передбачало послiдовне використання трьох сор-
бентiв: DЕАЕ-Toyopearl-М, фосфоцелюлози P23 та блакитної сефарози CL-6B. Кожен iз
сорбентiв урiвноважували буфером С (10 мМ трис-HCl, 1 мМ Na2ЕДТА, 7 мМ 2-меркап-
тоетанолу, 1 мМ ФМСФ, 10 мМ MgCl2). Хроматографiчне роздiлення в DЕАЕ-Toyopearl
проводили при pH 7,7, у фосфоцелюлозi — при pH 7,5, у блакитнiй сефарозi — при pH 8,0.
146 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №8
Рис. 1. Оптимуми активностей PboI: температурний (а), pH (б ), концентрацiї NaCl (в)
Елюцiю бiлкiв здiйснювали за допомогою лiнiйного градiєнта концентрацiї NaCl: для DЕАЕ-
Toyopearl — вiд 0,02 до 0,5 M, для фосфоцелюлози — вiд 0,13 до 1,0 М та для блакитної
сефарози — вiд 0,1 до 2,0 M. З блакитної сефарози першою елюювалася неспецифiчна ну-
клеаза, слiдом за нею — ендонуклеаза iз сайтспецифiчною активнiстю. Фракцiї iз сайтспеци-
фiчною активнiстю, загальний об’єм яких становив 2,5 мл, об’єднували, додавали альбумiн
бичачої сироватки до концентрацiї 50 мкг/мл та дiалiзували проти буфера для зберiгання
ферментiв (50%-й глiцерин, 10 мМ трис-HCl, pH 8,0, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2). Зразок
зберiгали при −20
◦С.
Згiдно з правилами класифiкацiї сайтспецифiчних ендонуклеаз [6], видiлений нами фер-
мент отримав назву PboI. Виявлено, що на його активнiсть не впливають такi коферменти,
як АТФ та SAM. Максимальну активнiсть фермент проявляє в реакцiйнiй сумiшi такого
складу: 10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2 та при температурi 45 ◦С
(рис. 1). В разi замiни в реакцiйнiй сумiшi Mg2+ на iншi двовалентнi катiони металiв,
зокрема Ca2+, Co2+, Zn2+ та Mn2+, спостерiгалось повне пригнiчення активностi фер-
менту (рис. 2). За результатами оптимiзацiї умов гiдролiзу встановлено, що з 1 г клiтин
P. boryanum може бути видiлено близько 2500 Од рестриктази PboI в об’ємi 2,5 мл. За
одиницю активностi приймали мiнiмальну кiлькiсть ферменту, необхiдного для повного гi-
дролiзу 1 мкг ДНК фага λ протягом 1 год в оптимальних умовах.
Для визначення сайтспецифiчностi ферменту як субстрат використовували ДНК фа-
га λ. 20 мкл реакцiйної сумiшi, яка мiстила 10 мМ трис-HСl, pH 7,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ
MgCl2, 1 мкг ДНК та 1 мкл рестриктази PboI, iнкубували протягом 1 год при 45 ◦C. Про-
дукти гiдролiзу роздiляли методом горизонтального електрофорезу в 0,7%-му агарозному
гелi в трис-боратнiй буфернiй системi. Аналiз електрофореграми (рис. 3) показав, що пiс-
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №8 147
Рис. 2. Активнiсть PboI у присутностi рiзних двовалентних катiонiв металiв
Рис. 3. Електрофореграма розподiлу фрагментiв ДНК фага λ, отриманих рестрикцiєю BamHI (дорiжка 4 )
та PboI (дорiжка 3 ). Дорiжка 1 — маркер (λ/HindIII); дорiжка 2 — нативна ДНК фага λ
ля рестрикцiї ДНК фага λ ферментами BamHI та PboI утворюються iдентичнi продукти
гiдролiзу. Так, BamHI гiдролiзує ДНК фага λ, що призводить до появи трьох фрагментiв
завдовжки 16841, 12275 та 7233 п. н., якi вiзуалiзуються на електрофореграмi у виглядi
трьох дискретних смуг. Четверта смуга складається з двох близьких за розмiрами фраг-
ментiв завдовжки 6770 та 6527 п. н., п’ята також є дуплетною i мiстить два фрагменти
завдовжки 5626 та 5505 п. н. Як видно з рис. 3, продукти гiдролiзу такої ж довжини утво-
рюються при розщепленнi ДНК фага λ рестриктазою PboI. Отже, PboI та BamHI впiзнають
однакову послiдовнiсть — GGATCC.
На сьогоднi вiдомо декiлька ферментiв рестрикцiї цiанобактерiального походження, що
впiзнають таку ж послiдовнiсть, як i PboI. Зокрема, AcaII (Anabaena catenula CCAP 1403/1),
AinII (Anabaena inequalis CCAP 1446/1a), AspTII (Anabaena species TA 1), Nsp29132II (Nos-
toc species ATCC 29132), NspSAIV (Nostoc species SA), видiленi з нитчастих цiанобактерiй,
148 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №8
та GseIII (Gloeocapsa species ATCC 29159), видiлений з одноклiтинної цiанобактерiї. Всього
вiдомо 94 рiзних ферментiв, якi розщеплюють вищезгадану послiдовнiсть.
Пiдсумовуючи результати проведеної роботи, звернемо увагу на те, що специфiчнiсть
ферментiв системи рестрикцiї–модифiкацiї позначається на структурних особливостях ДНК
як бактерiофагiв, так i їх господарiв — бактерiй. Наприклад, вiдомо, що цiанобактерiя
Plectonema boryanuт CALU 465 має dam-систему рестрикцiї–модифiкацiї, про що свiд-
чить вмiст метильованого аденiну в цiанобактерiальнiй ДНК у кiлькостi 4,5% та контр-
селекцiя послiдовностi GGATCC в ДНК цiанофага LPP-3, вiрулентного для цiанобактерiї
P. boryanuт [7]. Отже, можна вважати, що виявлена сайтспецифiчна ендонуклеаза PboI
є компонентом системи рестрикцiї–модифiкацiї dam-типу цiанобактерiї P. boryanum.
1. Linn S., Arber W. Host specificity of DNA produced by Escherichia coli X. In vitro restriction of phage
FD replication // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1968. – 59. – P. 1300–1309.
2. Roberts R. J., Belford M., Bestor T. et al. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases,
homing endonucleases and their genes // Nucl. Acids Res. – 2003. – 31. – P. 1805–1812.
3. Roberts R. J., Vincze T., Posfai J., Macelis D. REBASE – a database for DNA restriction and modification:
enzymes, genes and genomes // Ibid. – 2010. – 38. – P. 234–236.
4. Громов Б. В., Титова Н. Н. Коллекция культур водорослей лаборатории микробиологии Биологиче-
ского института Ленинградского университета // Культивирование коллекционных штаммов водо-
рослей. – Ленинград: Межвузовская типография, 1983. – С. 4–27.
5. Сырчин С.А., Цымбал Н.В., Самойленко В.А., Менджул М.И. Локализация нуклеазной активности
в клетках цианобактерии Plectonema boryanum CALU 465 // Микробиол. журн. – 2004. – 65. – С. 31–
35.
6. Smith H.O., Nathans D. A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems
and their enzymes // J. Mol. Biol. – 1973. – 81. – P. 419–423.
7. Сирчiн С. О. Структурний аналiз ДНК цiанофага LPP-3 та цiанобактерiї Plectionema boryanum: Дис.
. . . канд. бiол. наук: 03.00.06. – Київ, 1996. – 137 с.
Надiйшло до редакцiї 26.11.2010Iнститут мiкробiологiї i вiрусологiї
iм. Д.К. Заболотного НАН України, Київ
N.V. Тsymbal, V. A. Samoilenko, F. I. Tovkach
Site-specific endonuclease activity of filamentous cyanobacterium
Plectonema boryanum
The site-specific endonuclease PboI was isolated from the filamentous cyanobacterium Plectonema
boryanum. The purification included successive column chromatographies on DEAE-Toyopearl,
phosphocellulose, and blue sepharose. Purified enzyme recognizes and cleaves GGATCC -palindrome
sequence is analogously to Bam HI. The enzyme belongs to type II restriction endonucleases. Thе
enzyme activity is optimal at a temperature 45 ◦С, pH 7.5, and ionic strength 100 mM.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №8 149
|