MAST2-подобная протеинкиназа из винограда Vitis vinifera: клонирование кДНК, кодирующей каталитический домен

Ранее в рамках проекта по идентификации протеинкиназ, фосфорилирующих белки микротрубочек растений, с помощью биоинформационного подхода нами были обнаружены гены предполагаемых гомологов ассоциированной с микротрубочками в животных клетках протеинкиназы MAST2. Соответственно, ген наиболее близкого...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Date:	2010
Main Authors:	Брянцева, С.А., Гаврюшина, Е.С., Емец, А.И., Карпов, П.А., Блюм, Я.Б., Дрыгин, Ю.Ф., Надеждина, Е.С.
Format:	Article
Language:	Russian
Published:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2010
Series:	Цитология и генетика
Subjects:	Оригинальные работы
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66784
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	MAST2-подобная протеинкиназа из винограда Vitis vinifera: клонирование кДНК, кодирующей каталитический домен / С.А. Брянцева, Е.С. Гаврюшина, А.И. Емец, П.А. Карпов, Я.Б. Блюм, Ю.Ф. Дрыгин, Е.С. Надеждина // Цитология и генетика. — 2010. — Т. 44, № 4. — С. 41-47. — Бібліогр.: 33 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-66784
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-667842025-02-23T20:21:35Z MAST2-подобная протеинкиназа из винограда Vitis vinifera: клонирование кДНК, кодирующей каталитический домен MAST2-подібна протеїнкіназа з винограду Vitis vinifera: клонування кДНК, що кодує каталітичний домен MAST2-like protein kinase from grape vine Vitis vinifera: cloning of catalytic domain cDNA Брянцева, С.А. Гаврюшина, Е.С. Емец, А.И. Карпов, П.А. Блюм, Я.Б. Дрыгин, Ю.Ф. Надеждина, Е.С. Оригинальные работы Ранее в рамках проекта по идентификации протеинкиназ, фосфорилирующих белки микротрубочек растений, с помощью биоинформационного подхода нами были обнаружены гены предполагаемых гомологов ассоциированной с микротрубочками в животных клетках протеинкиназы MAST2. Соответственно, ген наиболее близкого гомолога MAST2, предполагаемого белка, названного нами GMLK (Grape MAST2 Like Kinase, A7NTE9_VITVI), был идентифицирован в геноме винограда Vitis vinifera. В настоящей работе приводятся результаты успешного клонирования кДНК белка GMLK (A7NTE9) из листьев винограда сорта Пино Нуар. Раніше у рамках проекту по ідентифікації протеїнкіназ, що фосфорилюють білки мікротрубочок рослин, за допомогою біоінформаційного підходу нами були виявлені гені передбачуваних гомологів асоційованої із мікротрубочками у тваринних клітинах протеїнкінази MAST2. Відповідно, ген найбільш близького гомолога MAST2, передбачуваного білка, названого нами GMLK (Grape MAST2-Like Kinase, A7NTE9_VITVI), був ідентифікований у геномі винограду Vitis vinifera. У даній роботі наводяться результати успішного клонування кДНК білка GMLK (A7NTE9) із листя винограду сорту Піно Нуар. The aim of our work is the identification of protein kinases phosphorylating microtubule proteins in plant cells. Using bioinformatic approach, we found genes of putative homologues of microtubule-associated mammalian protein kinase MAST2 in higher plant genomes. The gene of closest MAST2 homologue, putative protein, named GMLK (Grape MAST2 Like Kinase, A7NTE9_VITVI), was found in grape Vitis vinifera. We report here the cloning of cDNA of GMLK (A7NTE9) from Pinot Noir grape vine leaves. Настоящая работа была выполнена в рамках двустороннего проекта – 08 04 90454 «Сравнительный анализ киномов микротрубочек животных и высших растений» (Совместный конкурс Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ-НАН 08–04–90454-Укр_а) и Национальной академии наук Украины (08-04-90454, номер госрегистрации 0108U004809) в 2008–2009 гг. 2010 Article MAST2-подобная протеинкиназа из винограда Vitis vinifera: клонирование кДНК, кодирующей каталитический домен / С.А. Брянцева, Е.С. Гаврюшина, А.И. Емец, П.А. Карпов, Я.Б. Блюм, Ю.Ф. Дрыгин, Е.С. Надеждина // Цитология и генетика. — 2010. — Т. 44, № 4. — С. 41-47. — Бібліогр.: 33 назв. — рос. 0564-3783 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66784 577.212:004 ru Цитология и генетика application/pdf Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Оригинальные работы Оригинальные работы
spellingShingle	Оригинальные работы Оригинальные работы Брянцева, С.А. Гаврюшина, Е.С. Емец, А.И. Карпов, П.А. Блюм, Я.Б. Дрыгин, Ю.Ф. Надеждина, Е.С. MAST2-подобная протеинкиназа из винограда Vitis vinifera: клонирование кДНК, кодирующей каталитический домен Цитология и генетика
description	Ранее в рамках проекта по идентификации протеинкиназ, фосфорилирующих белки микротрубочек растений, с помощью биоинформационного подхода нами были обнаружены гены предполагаемых гомологов ассоциированной с микротрубочками в животных клетках протеинкиназы MAST2. Соответственно, ген наиболее близкого гомолога MAST2, предполагаемого белка, названного нами GMLK (Grape MAST2 Like Kinase, A7NTE9_VITVI), был идентифицирован в геноме винограда Vitis vinifera. В настоящей работе приводятся результаты успешного клонирования кДНК белка GMLK (A7NTE9) из листьев винограда сорта Пино Нуар.
format	Article
author	Брянцева, С.А. Гаврюшина, Е.С. Емец, А.И. Карпов, П.А. Блюм, Я.Б. Дрыгин, Ю.Ф. Надеждина, Е.С.
author_facet	Брянцева, С.А. Гаврюшина, Е.С. Емец, А.И. Карпов, П.А. Блюм, Я.Б. Дрыгин, Ю.Ф. Надеждина, Е.С.
author_sort	Брянцева, С.А.
title	MAST2-подобная протеинкиназа из винограда Vitis vinifera: клонирование кДНК, кодирующей каталитический домен
title_short	MAST2-подобная протеинкиназа из винограда Vitis vinifera: клонирование кДНК, кодирующей каталитический домен
title_full	MAST2-подобная протеинкиназа из винограда Vitis vinifera: клонирование кДНК, кодирующей каталитический домен
title_fullStr	MAST2-подобная протеинкиназа из винограда Vitis vinifera: клонирование кДНК, кодирующей каталитический домен
title_full_unstemmed	MAST2-подобная протеинкиназа из винограда Vitis vinifera: клонирование кДНК, кодирующей каталитический домен
title_sort	mast2-подобная протеинкиназа из винограда vitis vinifera: клонирование кднк, кодирующей каталитический домен
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
publishDate	2010
topic_facet	Оригинальные работы
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66784
citation_txt	MAST2-подобная протеинкиназа из винограда Vitis vinifera: клонирование кДНК, кодирующей каталитический домен / С.А. Брянцева, Е.С. Гаврюшина, А.И. Емец, П.А. Карпов, Я.Б. Блюм, Ю.Ф. Дрыгин, Е.С. Надеждина // Цитология и генетика. — 2010. — Т. 44, № 4. — С. 41-47. — Бібліогр.: 33 назв. — рос.
series	Цитология и генетика
work_keys_str_mv	AT brâncevasa mast2podobnaâproteinkinazaizvinogradavitisviniferaklonirovaniekdnkkodiruûŝejkatalitičeskijdomen AT gavrûšinaes mast2podobnaâproteinkinazaizvinogradavitisviniferaklonirovaniekdnkkodiruûŝejkatalitičeskijdomen AT emecai mast2podobnaâproteinkinazaizvinogradavitisviniferaklonirovaniekdnkkodiruûŝejkatalitičeskijdomen AT karpovpa mast2podobnaâproteinkinazaizvinogradavitisviniferaklonirovaniekdnkkodiruûŝejkatalitičeskijdomen AT blûmâb mast2podobnaâproteinkinazaizvinogradavitisviniferaklonirovaniekdnkkodiruûŝejkatalitičeskijdomen AT dryginûf mast2podobnaâproteinkinazaizvinogradavitisviniferaklonirovaniekdnkkodiruûŝejkatalitičeskijdomen AT nadeždinaes mast2podobnaâproteinkinazaizvinogradavitisviniferaklonirovaniekdnkkodiruûŝejkatalitičeskijdomen AT brâncevasa mast2podíbnaproteínkínazazvinograduvitisviniferaklonuvannâkdnkŝokoduêkatalítičnijdomen AT gavrûšinaes mast2podíbnaproteínkínazazvinograduvitisviniferaklonuvannâkdnkŝokoduêkatalítičnijdomen AT emecai mast2podíbnaproteínkínazazvinograduvitisviniferaklonuvannâkdnkŝokoduêkatalítičnijdomen AT karpovpa mast2podíbnaproteínkínazazvinograduvitisviniferaklonuvannâkdnkŝokoduêkatalítičnijdomen AT blûmâb mast2podíbnaproteínkínazazvinograduvitisviniferaklonuvannâkdnkŝokoduêkatalítičnijdomen AT dryginûf mast2podíbnaproteínkínazazvinograduvitisviniferaklonuvannâkdnkŝokoduêkatalítičnijdomen AT nadeždinaes mast2podíbnaproteínkínazazvinograduvitisviniferaklonuvannâkdnkŝokoduêkatalítičnijdomen AT brâncevasa mast2likeproteinkinasefromgrapevinevitisviniferacloningofcatalyticdomaincdna AT gavrûšinaes mast2likeproteinkinasefromgrapevinevitisviniferacloningofcatalyticdomaincdna AT emecai mast2likeproteinkinasefromgrapevinevitisviniferacloningofcatalyticdomaincdna AT karpovpa mast2likeproteinkinasefromgrapevinevitisviniferacloningofcatalyticdomaincdna AT blûmâb mast2likeproteinkinasefromgrapevinevitisviniferacloningofcatalyticdomaincdna AT dryginûf mast2likeproteinkinasefromgrapevinevitisviniferacloningofcatalyticdomaincdna AT nadeždinaes mast2likeproteinkinasefromgrapevinevitisviniferacloningofcatalyticdomaincdna
first_indexed	2025-11-25T03:45:06Z
last_indexed	2025-11-25T03:45:06Z
_version_	1849732437569961984
fulltext	УДК 577.212:004 С.А. БРЯНЦЕВА 1, Е.С. ГАВРЮШИНА 1, А.И. ЕМЕЦ 3, П.А. КАРПОВ 3, Я.Б. БЛЮМ 3, Ю.Ф. ДРЫГИН 1, Е.С. НАДЕЖДИНА 2 1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва 2 Институт белка РАН, Москва 3 Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины, Киев MAST2�ПОДОБНАЯ ПРОТЕИНКИНАЗА ИЗ ВИНОГРАДА VITIS VINIFERA: КЛОНИРОВАНИЕ кДНК, КОДИРУЮЩЕЙ КАТАЛИТИЧЕСКИЙ ДОМЕН Ранее в рамках проекта по идентификации протеин� киназ, фосфорилирующих белки микротрубочек растений, с помощью биоинформационного подхода нами были об� наружены гены предполагаемых гомологов ассоцииро� ванной с микротрубочками в животных клетках проте� инкиназы MAST2. Соответственно, ген наиболее близ� кого гомолога MAST2, предполагаемого белка, названного нами GMLK (Grape MAST2�Like Kinase, A7NTE9_VITVI), был идентифицирован в геноме винограда Vitis vinifera. В настоящей работе приводятся результаты успешного клонирования кДНК белка GMLK (A7NTE9) из листьев винограда сорта Пино Нуар. Введение. Микротрубочки играют принци� пиально важную роль в функционировании как животных, так и растительных клеток. Они необходимы для осуществления митоза и мейо� за, для обеспечения внутриклеточного транс� порта и позиционирования органелл, а также играют существенную роль в поддержании фор� мы клеток. В цитоплазме микротрубочки рас� положены неслучайно: они образуют системы, выглядящие как сети или пучки. Эти системы могут быть плотными, правильно организован� ными подобно веретену деления или достаточ� но рыхлыми, как в большинстве интерфазных животных клеток [1]. В растительных клетках микротрубочки обычно расположены регуляр� но: они ориентируются относительно длинной оси клеток [2]. Нарушение системы микро� трубочек влияет на клеточную морфологию [3]. Для функционирования системы микротрубо� чек важна как структура их сети, так и динамика отдельных микротрубочек, составляющих сеть. Микротрубочки – очень динамичные структу� ры, их сети легко перестраиваются в ответ на различные воздействия на клетки [4]. Дина� мика микротрубочек и перестройки их сетей могут регулироваться с помощью обратимого фосфорилирования составляющих микротру� бочки белков [5–7]. Особенно ярко паттерн фосфорилирования белков микротрубочек из� меняется при коренной перестройке их сети во время перехода к митозу [8–10], но он ва� жен также и в интерфазе [11]. Ранее мы продемонстрировали, что тубулин растительных микротрубочек подвергается ин� тенсивному фосфорилированию при помощи различных типов серин/треонин�протеинки� наз [12–14], а также тирозинкиназ [15, 16]. Не вызывает сомнения, что фосфорилирование и других белков, из которых состоят микротру� бочки растений, также катализируется различ� ными протеинкиназами [17–19]. Хотя некото� рые типы протеинкиназ, регулирующих функ� ции микротрубочек растений, могут быть иден� тифицированы с помощью селективных инги� биторов [20, 21], их спектр остается пока не изученным. Следовательно, идентификация на� бора протеинкиназ, составляющих кином микротрубочек, представляет собой актуальный вопрос. Показано, что некоторые белки, ассо� циированные с тубулином микротрубочек, об� ладают известной степенью сходства у живот� ных и растений [22]. Консервативен и сам ту� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 4 41 © С.А. БРЯНЦЕВА, Е.С. ГАВРЮШИНА, А.И. ЕМЕЦ, П.А. КАРПОВ, Я.Б. БЛЮМ, Ю.Ф. ДРЫГИН, Е.С. НАДЕЖДИНА, 2010 булин. Соответственно, можно предположить и консервативность многих типов протеинки� наз, регулирующих структуру и функциониро� вание микротрубочек у животных и растений. У животных известны около 20 протеинки� наз, ассоциированных с микротрубочками и/ или фосфорилирующих различные белки микротрубочек – «микротрубочковых» проте� инкиназ. В своей предыдущей работе мы пред� приняли биоинформационный поиск генов растительных протеинкиназ на основании го� мологии «микротрубочковым» протеинкиназам животных и человека [23–26]. Одной из таких протеинкиназ кинома микротрубочек человека является MAST2 (UniProt: MAST2_HUMAN; Q6P0Q8; синонимы: KIAA0807, MAST205) [27, 28]. Гомологи этой протеинкиназы име� ются во многих высших растениях [24–26]. Наиболее близким гомологом MAST2 оказал� ся предполагаемый белок GMLK (Grape MAST2�Like Kinase, A7NTE9_VITVI) из вино� града Vitis vinifera [24, 26]. Предполагаемый бе� лок GMLK насчитывает 423 аминокислотных остатка, и его ген располагается в хромосоме 18 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps. cgi?taxid=29760&chr=18). Цель настоящей работы заключалась в кло� нировании кДНК, кодирующей белок GMLK (A7NTE9_VITVI), из листьев винограда сорта Пино Нуар для дальнейшего изучения свойств этого белка. Материалы и методы. Выделение РНК. РНК выделяли из листьев винограда сорта Пино Ну� ар (Pinot Noir), собранных с растений коллек� ции винсовхоза «Ливадия» (Украина, Крым) и доставленных в лабораторию в свежем виде в течение 4 дней. Из вымытых и просушенных листьев вырезали кружки диаметром 3 см, за� мораживали их в жидком азоте и хранили при –70 °С в течение нескольких месяцев. Выделение РНК проводили по методу [29] с некоторыми модификациями. Для приготов� ления всех растворов использовали свободную от РНКаз тридистиллированную воду. Кружки, вырезанные из листьев, растирали в ступке с жидким азотом, 400 мг растертой в пудру ткани быстро помещали в пробирку на 2 мл, немед� ленно добавляли 1,4 мл прогретого до 80 °С бу� фера ХТ (0,2 М бората натрия, 0,03 М ЭДТA, 1 % SDS, 1 % дезоксихолата натрия, 2 % β�мер� каптоэтанола, 0,5 % спермидина, 1 % Тритона Х� 100, 2 % PVP�40 (молекулярная масса 36 000), pH 9,0), тщательно перемешивали и выдержи� вали 5 мин при 80 °С. Лизат охлаждали, добав� ляли 1 мг протеиназы К, инкубировали 1 ч при 42 °С при аккуратном перемешивании. Затем добавляли 2 M KCl до конечной кон� центрации 160 мМ, осторожно перемешивали, чтобы не разрушать ДНК, и выдерживали про� бирку 45 мин в ледяной бане. Центрифугиро� вали 15 мин при 6 °С 12700 об/мин (15 000 g) на центрифуге Eppendorf 5415 D (в дальнейшем условия центрифугирования были такими же). Супернатант переносили в новую пробирку на 2 мл, добавляли 1/3 объема 8 М LiCl до ко� нечной концентрации 2 М и β�меркаптоэта� нол до конечной концентрации 1 % (v/v), РНК осаждали в ледяной бане в течение ночи. Центрифугировали 25 мин, после чего отбира� ли супернатант. Затем два раза промывали оса� док 1 мл холодного раствора 2 М LiCl, центри� фугируя 15 мин. Суспендировали осадок в 600 мкл 10 мМ трис�HCl, pH 7,5, тщательно перемешивая при комнатной температуре. Добавляли 1/10 объема 2 M CH3COOK, pH 5,5, перемешивали и выдерживали 10 мин на ле� дяной бане. Центрифугировали 15 мин для удаления нерастворимого материала, перено� сили супернатант в новую пробирку. РНК пе� реосаждали, добавляя 0,9 объема холодного изопропанола, выдерживали 1 ч при –20 °С, центрифугировали 25 мин и промывали оса� док холодным 80%�ным этанолом. Осадок вы� сушивали в вакуум�эксикаторе и растворяли в 50 мкл тридистиллированной воды. Получение библиотеки кДНК и специфической кДНК. Для получения первой цепи ДНК исполь� зовали обратную транскриптазу Superscript II (Invitrogen) согласно инструкции производи� теля. Для получения специфической кДНК использовали последовательно две пары прай� меров: 1) прямой ATG TCA ACT CCT CTA CAT CCC TTA C и обратный AGT GTC TCG AGA TTT GGA TGG AC; 2) прямой AAA GAA TTC GAT GTC AAC TCC TCT ACA TCC C и обратный ATA GGT ACC AGT GTC TCG AGA TTT GGA TGG. Вторая пара праймеров содержала рестриктные сайты EcoRI и KpnI для клонирования. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) ставили в две стадии. Вначале проводи� ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 442 С.А. Брянцева, Е.С. Гаврюшина, А.И. Емец, П.А. Карпов, Я.Б. Блюм, Ю.Ф. Дрыгин, Е.С. Надеждина ли реакцию с 2 мкл библиотеки кДНК вино� града и первой парой праймеров, 1 цикл: 94°С 30 с, 49 °С 30 с, 2–40 циклов, 72 °С 80 с. Затем брали 2 мкл смеси из этой реакции и ставили новый ПЦР со второй парой праймеров в тех же условиях, но проводили 30 циклов ампли� фикации. Секвенирование ДНК осуществляли с по� мощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим ана� лизом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems в Межинститутском Центре кол� лективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН (http://www.genome�centre.narod.ru/), органи� зованном при поддержке РФФИ. Клонирование кДНК и ее экспрессия в культи0 вируемых животных клетках. Полученную спе� цифическую кДНК (ПЦР�продукт) встраивали в вектор pEGFP�C1 («Clontech», США) по сай� там EcoRI/KpnI. Использовали рестриктазы и лигазу фирмы «Fermentas» (Литва). Полученную плазмиду pEGFP�MAST2HP наращивали в Es� cherichia coli (штамм DH�5α), очищали с помо� щью набора QIAprep Spin MiniPrep («Qiagen», Германия) по инструкции производителя. Клетки Vero (клетки почки зеленой мар� тышки) культивировали в среде DMEM/F12 («PanEco», Россия) с добавлением 10 % эмбрио� нальной телячьей сыворотки. Для трансфек� ции использовали реагент Lipofectamin 2000 («Invitrogen», США). Через 20 ч после трансфек� ции клетки фиксировали 4%�ным формальде� гидом и проводили иммуноокрашивание микротрубочек с помощью моноклональных антител DM�1a к тубулину («Sigma�Aldrich», США) и козьих антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с родамином («Jack� son Immunoresearch», США). Препарат про� сматривали в микроскопе Axiovert 2000M («Carl Zeiss», Германия) и фотографировали с помощью цифровой видеокамеры AxioCam HRc («Carl Zeiss»), управляемой программой AxioVision 3.1 («Carl Zeiss Vision»). Результаты исследований и их обсуждение. Для клонирования кДНК белка GMLK (A7NTE9_VITVI) нами было решено выделить РНК из листьев винограда, изготовить библио� теку кДНК, с помощью ПЦР амплифицировать специфическую кДНК, кодирующую белок GMLK, клонировать ее в векторе для эксп� рессии в животных клетках и, трансфициро� вав животные клетки, проверить, способен ли белок синтезироваться в растворенном виде и не токсичен ли он для клеток. При осуществле� нии этого плана для начала была предпринята попытка выделения РНК из листьев винограда с помощью набора RNeasy Plant Mini Kit («Qia� gen», Германия). Эта попытка оказалась безус� пешной – выход РНК был очень небольшим (менее 5 нг/ мкл), и рибосомную РНК не было видно на электрофорезе. Впрочем, подобные результаты были получены с тканями вино� града при применении набора RNeasy Plant и другими авторами [29, 30]. Поэтому нами было решено использовать другие методы вы� деления РНК, в частности метод, изложенный в работе Moser et al. [29], с внесением некото� рых модификаций. Выделение РНК согласно протоколу, описанному в «Материалах и ме� тодах», позволило получить около 10 мкг РНК в конечном препарате из 400 мг ткани, причем РНК в процессе выделения избавлялась от за� грязняющих ее пигментов. Судя по результатам электрофореза, РНК имела удовлетворитель� ное качество, несмотря на некоторую степень деградации 25S рибосомной РНК (рис. 1). Выделенный препарат РНК листьев вино� града использовали для получения библиоте� ки кДНК. Для этого проводили реакцию с об� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 4 43 MAST20подобная протеинкиназа из винограда Vitis vinifera: клонирование кДНК Рис. 1. Электрофорез в 1%� ной агарозе с 0,5 мкг/мл бромистого этидия в ТВЕ� системе: 1 – суммарная РНК клеток асцитной кар� циномы Кребс II (3 мкг); 2 – суммарная РНК из листьев винограда (1 мкг). Обозна� чена рибосомная РНК ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 444 С.А. Брянцева, Е.С. Гаврюшина, А.И. Емец, П.А. Карпов, Я.Б. Блюм, Ю.Ф. Дрыгин, Е.С. Надеждина Рис. 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей клонированного белка MAST2HP и белка GMLK (A7NTE9) (а), а также протеинкиназы MAST2 человека HuMAST2 (фрагмент) (б). Выравнивание выполнено с помощью NCBI BLAST 2 сервиса c помощью программ [20] ратной транскриптазой SuperScript, как описа� но в «Материалах и методах». По нашему пре� дыдущему опыту, SuperScript дает гораздо луч� шие результаты при получении библиотек кДНК, чем другие обратные транскриптазы. Для изолирования специфической кДНК использовали ранее созданную библиотеку кДНК. После проведения первого раунда ПЦР (40 циклов с первой парой праймеров) ПЦР� продукт получался несколько гетерогенным. Поэтому использовали еще 30 циклов ПЦР со второй парой праймеров, что привело к полу� чению четкой полосы ПЦР�продукта при его анализе в агарозном электрофорезе (данные не представлены). Результаты секвенирования ПЦР�продукта показали его однородность и соответствие целевому белку GMLK. После встраивания в вектор было проведено полное секвенирование встройки по обеим цепям ДНК, и его результаты подтвердили правиль� ность встройки кДНК в вектор, а также нали� чие открытой рамки считывания по всей дли� не встройки, со стоп�кодоном в ее конце. Клонированная нами кДНК и предсказы� ваемый кодируемый белок (MAST2�homologous protein – MAST2HP) практически полностью совпадали по первичной структуре с белком GMLK (A7NTE9_VITVI) и кодирующей его кДНК (рис. 2). Нами было обнаружено семь то� чечных замен нуклеотидов, приводящих к четырем точечным заменам аминокислот. Эти расхождения могут быть следствием исполь� зования разных сортов винограда при клони� ровании GMLK и MAST2HP или же могут быть вызваны ошибками ПЦР при получении обоих образцов. Расхождения не затронули функционально важных участков каталити� ческого киназного домена, входящего в состав MAST2HP. Нами была также проведена экспрессия по� лученного конструкта в гетерологичной сис� теме: в культивируемых клетках Vero (рис. 3). Продукт экспрессии, выявляемый по свечению зеленого флюоресцентного белка, достаточно равномерно распределялся по цитоплазме и ядру клеток, отмечались лишь небольшие тельца включения. Клетки, экспрессирующие конструкт, в своем большинстве не утрачива� ли жизнеспособности, они делились, что было видно по наличию пар клеток, связанных оста� точными тельцами (рис. 3, а). Система мик� ротрубочек чаще всего не отличалась от конт� роля, однако иногда отмечали ее коллапс с образованием пучков микротрубочек (рис. 3, б). Нередко наблюдали изменение формы кле� ток – клетки образовывали длинные выросты (рис. 3, в). Таким образом, белок MAST2HP не является высокотоксичным для клеток, эк� спрессируется в растворенной форме даже в ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 4 45 MAST20подобная протеинкиназа из винограда Vitis vinifera: клонирование кДНК Рис. 3. Микротрубочки в культивируемых клетках Vero, экспрессирующих pEGFP�MAST2HP: а – пара клеток после деления, б – перестройка системы микротрубо� чек (стрелка), в – изменение формы клетки (отростки показаны стрелками). Слева – вид клеток во флюо� ресцентном канале для GFP, справа – вид клеток во флюоресцентном канале для родамина. Масштабная линейка – 20 мкм гетерологичной системе и возможно, что дей� ствительно влияет на систему микротрубочек. Ранее было показано, что гетерологичная эк� спрессия MAST205 в клетках животных при� водит к полноценному функционированию этой киназы, однако при условии наличия ки� назного домена [32]. Делеция же киназного домена или доминант�негативная мутация в гене, кодирующем MAST205, нарушает ее функциональную активность. Следовательно, можно предположить, что функции белка MAST2HP в гетерологичных клеточных системах могут реализовываться посредством зависимого от фосфорилирова� ния механизма. Известны также работы, в которых изучали функционирование другой группы связанных с микротрубочками потеинкиназ в гетерологич� ных растительных клеточных системах – Аврора�подобных протеинкиназ арабидопсиса [33]. Поэтому в дальнейшем для изучения свойств исследуемого белка в клетках расте� ний нами планируется клонировать слитый с GFP MAST2HP в вектор pROC для агробак� териальной трансформации. Настоящая работа была выполнена в рамках двустороннего проекта – 08�04�90454 «Сравни� тельный анализ киномов микротрубочек живот� ных и высших растений» (Совместный конкурс Российского фонда фундаментальных исследова� ний (РФФИ�НАН 08–04–90454�Укр_а) и Нацио� нальной академии наук Украины (08�04�90454, номер госрегистрации 0108U004809) в 2008– 2009 гг. S.A. Bryantseva, E.S. Gavryushina, A.I. Yemets, P.A. Karpov, Ya.B. Blume, Yu.F. Drygin, E.S. Nadezhdina MAST2�LIKE PROTEIN KINASE FROM GRAPE VINE VITIS VINIFERA: CLONING OF CATALYTIC DOMAIN сDNA The aim of our work is the identification of protein kinases phosphorylating microtubule proteins in plant cells. Using bioinformatic approach, we found genes of puta� tive homologues of microtubule�associated mammalian protein kinase MAST2 in higher plant genomes. The gene of closest MAST2 homologue, putative protein, named GMLK (Grape MAST2�Like Kinase, A7NTE9_VITVI), was found in grape Vitis vinifera. We report here the cloning of cDNA of GMLK (A7NTE9) from Pinot Noir grape vine leaves. С.А. Брянцева, Є.С. Гаврюшіна, А.І. Ємець, П.А. Карпов, Я.Б. Блюм, Ю.Ф. Дригін, Є.С. Надєждіна MAST2�ПОДІБНА ПРОТЕЇНКІНАЗА З ВИНОГРАДУ VITIS VINIFERA: КЛОНУВАННЯ кДНК, ЩО КОДУЄ КАТАЛІТИЧНИЙ ДОМЕН Раніше у рамках проекту по ідентифікації протеїн� кіназ, що фосфорилюють білки мікротрубочок рос� лин, за допомогою біоінформаційного підходу нами були виявлені гені передбачуваних гомологів асоційо� ваної із мікротрубочками у тваринних клітинах протеїн� кінази MAST2. Відповідно, ген найбільш близького го� молога MAST2, передбачуваного білка, названого на� ми GMLK (Grape MAST2�Like Kinase, A7NTE9_VITVI), був ідентифікований у геномі винограду Vitis vinifera. У даній роботі наводяться результати успішного кло� нування кДНК білка GMLK (A7NTE9) із листя вино� граду сорту Піно Нуар. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Wade R.H. On and around microtubules: an overview // Mol. Biotechnol. – 2009. – 43, № 2. – Р. 177–191. 2. Wasteneys G.O. Progress in understanding the role of microtubules in plant cells // Curr. Opin. Plant Biol. – 2004. – 7, № 6. – Р. 651–660. 3. Minc N., Bratman S.V., Basu R., Chang F. Establishing new sites of polarization by microtubules // Curr. Biol. – 2009. – 19, № 2. – Р. 83–94. 4. Lopus M., Yenjerla M., Wilson L. Microtubule Dynamics (Advanced Review) // Wiley Encyclopedia of Chemical Biology / Ed. T.P. Begley. – NJ : Wiley, 2009. – Vol. 3. – P. 153–160. 5. Hammond J.W., Cai D., Verhey K.J. Tubulin modifica� tions and their cellular functions // Curr. Opin. Cell Biol. – 2008. – 20, № 1. – Р 71–76. 6. Verhey K.J., Gaertig J. The tubulin code // Cell Cycle. – 2007. – 6, № 17. – P. 2152–2160. 7. Westermann S., Weber K. Post�translational modifica� tions regulate microtubule function // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. – 2003. – 4, № 12. – P. 938–947. 8. Fourest�Lieuvin A., Peris L., Gache V. et al. Microtubule regulation in mitosis: tubulin phosphorylation by the cyclin�dependent kinase Cdk1 // Mol. Biol. Cell. – 2006. – 17, № 3. – P. 1041–1050. 9. Hong K.U., Kim H.J., Kim H.S. et al. Cdk1�cyclin B1� mediated phosphorylation of tumor�associated micro� tubule�associated protein/cytoskeleton�associated pro� tein 2 in mitosis // J. Biol. Chem. – 2009. – 284, № 24. – P. 16501–16512. 10. Kufer T.A., Nigg E.A., Silljé H.H. Regulation of Aurora� A kinase on the mitotic spindle // Chromosoma. – 2003. – 112, № 4. – P. 159–163. 11. Holmfeldt P., Stenmark S., Gullberg M. Interphase�spe� cific phosphorylation�mediated regulation of tubulin ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 446 С.А. Брянцева, Е.С. Гаврюшина, А.И. Емец, П.А. Карпов, Я.Б. Блюм, Ю.Ф. Дрыгин, Е.С. Надеждина dimer partitioning in human cells // Mol. Biol. Cell. – 2007. – 18, № 5. – P. 1909–1917. 12. Blume Ya., Smertenko A., Ostapets N.N., Viklicky V., Draber P. Post�translational modifications of plant tubulin // Cell Biol. Int. – 1997. – 21. – P. 918–920. 13. Ben�Nissan G., Cui W., Kim D.�J. et al. Arabidopsis casein kinase 1�like 6 contains a microtubule�binding domain and affects the organization of cortical microtubules // Plant Physiol. – 2008. – 148. – P. 1897–1907. 14. Yemets А.І., Lloyd С., Blume Ya.B. Plant tubulin phos� phorylation and its role in cell cycle progression // The Plant Cytoskeleton: Key Tool for Agro�Biotechnology / Eds W.V. Baird, Ya.B. Blume, D. Breviario, A.I. Yemets. – Dordreht : Springer, 2008. – P. 145–159. 15. Blume Y., Yemets A., Sheremet Y. et al. Exposure of beta�tubulin regions defined by antibodies on an Arabidopsis thaliana microtubule protofilament model and in the cells // BMC Plant Biol. – 2010. – 10, № 1. – #29. [doi:10.1186/1471–2229–10–29.] 16. Blume Ya.B., Yemets А.І., Sulimenko V. et al. Tyrosine phosphorylation of tubulin in plant cells // Planta. – 2008 – 229, № 1. – P. 143–150. 17. Liu B.�Q., Jin L., Zhu L., Li J., Huang S., Yuan M. Phos� phorylation of microtubule�associated protein SB401 from Solanum berthaultii regulates its effect on micro� tubules // J. Integr. Plant Biol. – 2009. – 51, № 3. – P. 235–242. 18. Sasabe M., Soyano T., Takahashi Y. et al. Phosphory� lation of NtMAP65–1 by a MAP kinase down�regu� lates its activity of microtubule bundling and stimulates progression of cytokinesis of tobacco cells // Genes Dev. – 2006. – 20. – P. 1004–1014. 19. Walia A., Lee J.S., Wasteneys G., Ellis B. Arabidopsis mitogen�activated protein kinase MPK18 mediates cortical microtubule functions in plant cells // Plant J. – 2009. – 59, № 4. – P. 565–575. 20. Шеремет Я.А., Емец А.И., Виссенберг К., Вербе� лен Ж.�П., Блюм Я.Б. Влияние ингибиторов се� рин/треонин протеинкиназ на морфологию корня Arabidopsis thaliana и организацию микротрубочек в его клетках // Цитология. – 2010. – 52, № 5. – C. 389–398. 21. Yemets A., Sheremet Y., Vissenberg K., Van Orden J., Verbelen J.P., Blume Y.B. Effects of tyrosine kinase and phosphatase inhibitors on microtubules in Arabidopsis root cells // Cell Biol. Int. – 2008. – 32, № 6. – P. 630– 637. 22. Karpov P.А., Blume Ya.B. Bioinformatic search for plant homologues of animal structural MAPs in the Arabidopsis thaliana genome // The Plant Cytoskeleton: Key Tool for Agro�Biotechnology / Eds W.V. Baird, Ya.B. Blume, D. Breviario, A.I. Yemets. – Dordreht : Springer, 2008. – P. 373–394. 23. Карпов П.А., Емец А.И., Матусов В.Г., Ныпорко А.Ю., Надеждина Е.С., Блюм Я.Б. Биоинформационный поиск растительных гомологов Ste20�подобных серин/треониновых протеинкиназ // Цитология и генетика. – 2009. – 43, № 6. – С. 68–77. 24. Карпов П.А., Емец А.И., Матусов В.Г., Ныпорко А.Ю., Надеждина Е.С., Шашина Н.Ю., Блюм Я.Б. Биоин� формационный поиск растительных гомологов ас� социированной с микротрубочками протеинкина� зы MAST2 // Тр. Никит. бот. сада. – 2009. – 131. – С. 181–187. [http://www.nbuv.gov.ua/portal/Chem_ Biol/znpdnbs/2009_131.pdf] 25. Карпов П.А., Надеждина Е.С., Емец А.И., Мату� сов В.Г., Ныпорко Н.Ю., Шашина Н.Ю., Блюм Я.Б. Биоинформационный поиск растительных протеин� киназ, участвующих в фосфорилировании белков микротрубочек и регуляции деления клеток // Ци� тология и генетика. – 2009. – 43, № 3. – С. 63–79. 26. Karpov P.A., Nadezhdina E.S., Yemets A.I., Matusov V.G., Nyporko A.Yu., Shashina N.Yu., Blume Ya.B. Bioinfor� matic search of plant microtubule� and cell cycle relat� ed serine�threonine protein kinases // BMC Genome. – 2010. – 11(Suppl 1): S14. – doi:10.1186/1471–2164– 11�S1�S14. 27. Garland P., Quraishe S., French P., O’Connor V. Expres� sion of the MAST family of serine/threonine kinases // Brain Res. – 2008. – 1195. – P. 12–19. 28. Manning G., Whyte D.B., Martinez R., Hunter T., Sudarsanam S. The protein kinase complement of the human genome // Science. – 2002. – 298. – P. 1912– 1934. 29. Moser C., Gatto P., Moser M., Pindo M., Velasco R. Isolation of functional RNA from small amounts of dif� ferent grape and apple tissues // Mol. Biotechnol. – 2004. – 26, № 2. – P. 295–299. 30. Gambino G., Perrone I., Gribaudo I. A rapid and effec� tive method for RNA extraction from different tissues of grapevine and other woody plants // Phytochem. Anal. – 2008. – 19, № 6. – P. 520–525. 31. Altschul S.F., Madden T.L., Schäffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI�BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucl. Acids Res. – 1997. – 25. – P. 3389– 3402. 32. Wang D., Lee H.J., Cooper D.S., Cebotaro L., Walden P.D., Choi I., Yun C.C. Coexpression of MAST205 inhibits the activity of Na+/H+ exchanger NHE3 // Amer. J. Physiol. Renal. Physiol. – 2006. – 290, № 2. – F. 428– 437. 33. Demidov D., Van Damme D., Geelen D., Blattner F.R., Houben A. Identification and dynamics of two classes of Aurora�like kinases in Arabidopsis and other plants // Plant Cell. – 2005. – 17, № 3. – P. 836–848. Поступила 20.11.09 ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 4 47 MAST20подобная протеинкиназа из винограда Vitis vinifera: клонирование кДНК

MAST2-подобная протеинкиназа из винограда Vitis vinifera: клонирование кДНК, кодирующей каталитический домен

Institution

Similar Items