Модифікований протокол фарбування сафраніном О та астра синім для цілей гістології рослин
Many staining protocols are widely applied in botanical microtechniques and serve specific histological purposes. In particular, some dyes are used simultaneously to receive contrasting colorations of different chemical structures, e.g., lignin and cellulose. One of the most popular differential sta...
Saved in:
| Date: | 2021 |
|---|---|
| Main Authors: | , |
| Format: | Article |
| Language: | English |
| Published: |
M.M. Gryshko National Botanical Garden of the NAS of Ukraine
2021
|
| Online Access: | https://www.plantintroduction.org/index.php/pi/article/view/1587 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Plant Introduction |
| Download file: |  |
Institution
Plant Introduction| _version_ | 1860145111691689984 |
|---|---|
| author | Novikov, Andriy Sup-Novikova, Mariia |
| author_facet | Novikov, Andriy Sup-Novikova, Mariia |
| author_sort | Novikov, Andriy |
| baseUrl_str | https://www.plantintroduction.org/index.php/pi/oai |
| collection | OJS |
| datestamp_date | 2023-08-26T20:39:20Z |
| description | Many staining protocols are widely applied in botanical microtechniques and serve specific histological purposes. In particular, some dyes are used simultaneously to receive contrasting colorations of different chemical structures, e.g., lignin and cellulose. One of the most popular differential staining protocols is based on the Safranin O / Astra Blue dyes combination. Safranin O is a water-soluble basic dye that stains lignin in red. Astra Blue is also a water-soluble dye but having an acidic reaction, which stains cellulose in blue. Usually, a 1–2 % solution of Safranin O in distilled water or 50–70 % ethanol is applied in combination with the 0.5–1 % water solution of Astra Blue to detect lignified structures and obtain contrasting pictures convenient for the light microscopy. For a long time, Astra Blue was used exclusively with water solutions, and such recommendation without additional options is indicated on producers’ web sites. However, in 2002 it was proposed to use 1 % Astra Blue solution in 95 % ethanol to identify the lignified tissues. Later, such an ethanol solution of Astra Blue was also successfully applied by other researchers for different experimental purposes.We tested the modified staining protocol with the application of both 1 % Safranin O and Astra Blue solutions in a slightly lower concentration of ethanol (70 %) on the flower buds of Gagea lutea (Liliaceae) and found it working well. We believe that such a modified protocol with the solutions of these two dyes in 70 % ethanol allows simplifying the procedure of the plant material staining due to application of the same concentrations of dissolvent and reducing the difference in solvent concentration between two following contrasting staining solutions. Such differential staining can be effectively applied for plant histology purposes, especially where there is a need to distinguish lignified structures and secretory tissues. |
| doi_str_mv | 10.46341/PI2021005 |
| first_indexed | 2025-07-17T12:53:56Z |
| format | Article |
| fulltext |
© The Authors. This content is provided under CC BY 4.0 license.
Plant Introduction, 89/90, 110–113 (2021)
SHORT COMMUNICATION
Modified staining protocol with Safranin O and Astra Blue for the plant
histology
Andriy Novikov 1, *, Mariia Sup-Novikova 2
1 State Natural History Museum, National Academy of Sciences of Ukraine, Teatralna str. 18, 79008 Lviv, Ukraine;
* novikoffav@gmail.com
2 Ukrainian Catholic University, Stryiska str. 29A, 79000 Lviv, Ukraine
Received: 19.05.2021 | Accepted: 31.05.2021 | Published online: 16.06.2021
Abstract
Many staining protocols are widely applied in botanical microtechniques and serve specific histological
purposes. In particular, some dyes are used simultaneously to receive contrasting colorations of different
chemical structures, e.g., lignin and cellulose. One of the most popular differential staining protocols is
based on the Safranin O / Astra Blue dyes combination. Safranin O is a water-soluble basic dye that stains
lignin in red. Astra Blue is also a water-soluble dye but having an acidic reaction, which stains cellulose in
blue. Usually, a 1–2 % solution of Safranin O in distilled water or 50–70 % ethanol is applied in combination
with the 0.5–1 % water solution of Astra Blue to detect lignified structures and obtain contrasting pictures
convenient for the light microscopy. For a long time, Astra Blue was used exclusively with water solutions,
and such recommendation without additional options is indicated on producers’ web sites. However, in
2002 it was proposed to use 1 % Astra Blue solution in 95 % ethanol to identify the lignified tissues. Later,
such an ethanol solution of Astra Blue was also successfully applied by other researchers for different
experimental purposes.
We tested the modified staining protocol with the application of both 1 % Safranin O and Astra Blue
solutions in a slightly lower concentration of ethanol (70 %) on the flower buds of Gagea lutea (Liliaceae)
and found it working well. We believe that such a modified protocol with the solutions of these two dyes in
70 % ethanol allows simplifying the procedure of the plant material staining due to application of the same
concentrations of dissolvent and reducing the difference in solvent concentration between two following
contrasting staining solutions. Such differential staining can be effectively applied for plant histology
purposes, especially where there is a need to distinguish lignified structures and secretory tissues.
Keywords: Astra Blue, Safranin O, histological dyes, botanical microtechnique, lignin detection
https://doi.org/10.46341/PI2021005
UDC 58.086
Authors’ contributions: A. Novikov designed an experiment and conducted the staining tests. A. Novikov prepared the draft of the
manuscript. M. Sup-Novikova assisted during the tests, verified protocols, and contributed to the manuscript edition.
Funding: This investigation was fully covered by A. Novikov personal funds.
Competing Interests: The authors declared that they have no conflict of interests.
Many different staining protocols are widely
applied in botanical microtechniques and
serve specific histological purposes (Berlyn &
Miksche, 1976; Gerlach, 1984; Barykina et al.,
2004; Soukup & Tylova, 2019). In particular,
some dyes are used simultaneously to receive
contrasting colorations of different chemical
structures, e.g., lignin and cellulose. One of
the most popular and convenient differential
staining protocols is based on the application
https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
https://orcid.org/0000-0002-0112-5070
https://orcid.org/0000-0002-8542-3605
Plant Introduction • 89/90 111
Modified staining protocol with Safranin O and Astra Blue for the plant histology
of Safranin O and Astra Blue dyes by turns.
Safranin O is a water-soluble basic dye
(pH = 10.0) that stains lignin in red. Astra Blue
is a water-soluble acidic dye (pH = 4.9) that
stains cellulose in blue but only in the absence
of lignin (Srebotnik & Messner, 1994). Usually, a
1–2 % solution of Safranin O in distilled water
or 50–70 % ethanol is applied in combination
with 0.5–1 % water solution of Astra Blue
(Srebotnik & Messner, 1994; Goujon et al.,
2003; Barykina et al., 2004; Feio et al., 2016).
For a long time, Astra Blue was used exclusively
with water solutions. However, Vazquez-Cooz
& Meyer (2002) proposed to use approx. 1 %
Astra Blue dissolved in 95 % ethanol. Later,
such an ethanolic solution of Astra Blue was
also successfully applied by other researchers
(De Micco & Aronne, 2007; Richet et al., 2011,
and others).
We tested the modified staining protocol
with the application of both 1% Safranin O
(C.I. 50240) and Astra Blue (C.I. 48048)
solutions in 70% ethanol. The flower buds of
Gagea lutea (L.) Ker Gawl. (Liliaceae Juss.) were
fixed in 70 % ethanol, embedded in Paraplast
Plus (McCormick Scientific), and later cut
on the rotary microtome MPS-2 onto 20 µm
thick cross-sections. Cross-sections were
mounted on glass slides and later processed
the following protocol:
A. Deparaffinization
1. Xylene, 25 min.
2. Xylene, 25 min.
B. Rehydration
3. Absolute ethanol, 10 min.
4. 96 % ethanol, 10 min.
5. 70 % ethanol, 10 min.
C. Staining
6. 1 % Safranin O in 70% ethanol, h.
7. Rinse in the extra volume of 70 %
ethanol
8. Contrasting by 70 % ethanol, 5–10 min.
9. Contrasting by 70 % ethanol, 5–10 min.
10. 1 % Astra Blue in 70 % ethanol, 10 min.
11. Rinse in the extra volume of 96 %
ethanol
D. Dehydration and further contrasting
12. 96 % ethanol, 5–10 min.
13. Absolute ethanol, 10 min.
14. Absolute ethanol : xylene (1 : 1), 15 min.
E. Infiltration by resin solvent
15. Xylene, 15 min.
16. Xylene, 15 min.
After that, slides were embedded in Roti
Histokit II (Carl Roth GmbH) and left to dry
for one day. On the next day, they were
examined under Amplival (Carl Zeiss Jena)
light microscope (Fig. 1). Pictures were taken
by Canon EOS 650 camera with microscope
adapter.
We believe that such protocol with the
solutions of these two dyes in 70 % ethanol
allows simplifying the staining procedure due
to using the same concentrations of dissolvent
and reducing the difference in solvent
concentration between two contrasting
staining solutions. Such differential staining
can be effectively applied for plant histology
purposes, particularly where there is a need to
distinguish lignified structures and secretory
tissues. Astra Blue stains cellulose and
unlignified cell walls in light blue color, while
lignified structures obtain different shades of
red or brown color as a result of incorporating
Safranin O in tissues. Safranin O also stains
in dark red or pink color the nuclei and
protoplasm of secretory tissues. However, the
success and degree of coloration by Safranin O
significantly depends on lignification level,
quality of material, and staining exposure.
Even after two hours of staining by Safranin O,
it was dramatically washed out from tissues
after five minutes of exposure in each of the
following ethanols. It is crucial to control the
time of exposure of slides in ethanols carefully
or to stain the slides by Astra Blue before
putting them in Safranin O. Therefore, this
protocol must be checked and adopted for
each kind of material (e.g., flower, bark, stem
or root tissues, or other specific tissues and
purposes).
References
Barykina, R. P., Veselova, T. D., Deviatov, A. G.,
Djalilova, H. H., Iljina, G. M., & Chubatova, N. V.
(2004). Handbook of the botanical microtechniques.
Moscow University Press. (In Russian)
Berlyn, P.G., & Miksche, J.P. (1976). Botanical
microtechnique and cytochemistry. The Iowa State
University Press.
De Micco, V., & Aronne, G. (2007). Combined
histochemistry and autofluorescence for
identifying lignin distribution in cell walls.
Biotechnic & Histochemistry, 82(4–5): 209–216.
https://doi.org/10.1080/10520290701713981
https://doi.org/10.1080/10520290701713981
112 Plant Introduction • 89/90
A. Novikov, M. Sup-Novikova
Feio, A.C., Riina, R., & Meira, R. (2016). Secretory
structures in leaves and flowers of two dragon’s
blood croton (Euphorbiaceae): new evidence
and interpretations. International Journal of
Plant Sciences, 177(6), 511–522. https://doi.
org/10.1086/685705
Gerlach, D. (1984). Botanische Mikrotechnik – Eine
Einführung. 3. Thieme.
Goujon, T., Ferret, V., Mila, I., Pollet, B., Ruel, K.,
Burlat, V., Joseleau, J., Barrière, Y., Lapierre, C.,
& Jouanin, L. (2003). Down-regulation of the
AtCCR1 gene in Arabidopsis thaliana: effects on
phenotype, lignins and cell wall degradability.
Planta, 217, 218–228. https://doi.org/10.1007/
s00425-003-0987-6
Richet, N., Afif, D., Huber, F., Pollet, B., Banvoy, J.,
Zein, R.E., Lapierre, C., Dizengremel, P.,
Perré, P., & Cabané, M. (2011). Cellulose and
lignin biosynthesis is altered by ozone in wood
of hybrid poplar (Populus tremula×alba). Journal of
Experimental Botany, 62(10), 3575–3586. https://
doi.org/10.1093/jxb/err047
Soukup, A., & Tylová, E. (2019). Essential methods
of plant sample preparation for light microscopy.
In: F. Cvrčková & V. Žárský (Eds.), Plant cell
morphogenesis. Methods in Molecular Biology, 1992,
1–26. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9469-
4_1
Srebotnik, E., & Messner, K. (1994). A simple
method that uses differential staining and
light microscopy to assess the selectivity of
wood delignification by white rot fungi. Applied
and Environmental Microbiology, 60(4), 1383–
1386. https://doi.org/10.1128/aem.60.4.1383-
1386.1994
Vazquez-Cooz, I., & Meyer, R. W. (2002). A
differential staining method to identify lignified
and unlignified tissues. Biotechnic & Histochemistry,
77, 277–282. https://doi.org/10.1080/bih.77.5-
6.277.282
B
С
A
Figure 1. Examples of staining of Gagea lutea
floral parts by ethanol solutions of Safranin O
and Astra Blue. A – a fragment of the receptacle
with lignified tracheal elements of the vascular
bundle stained in red by Safranin O; B –an anther
theca with fibrous endothecium stained in light
blue by Astra Blue and pollen grains stained in
brown by Safranin O; C – a fragment of style with
the secretory epidermis of the channel stained
in pink or red by Safranin O and Astra Blue.
iep – inner epidermis; mw – microsporangium
wall; oep – outer epidermis; pch – parenchyma;
ph – phloem; pg – pollen grain; sc – style channel;
xl – xylem.
https://doi.org/10.1086/685705
https://doi.org/10.1086/685705
https://doi.org/10.1007/s00425-003-0987-6
https://doi.org/10.1007/s00425-003-0987-6
https://doi.org/10.1093/jxb/err047
https://doi.org/10.1093/jxb/err047
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9469-4_1
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9469-4_1
https://doi.org/10.1128/aem.60.4.1383-1386.1994
https://doi.org/10.1128/aem.60.4.1383-1386.1994
https://doi.org/10.1080/bih.77.5-6.277.282
https://doi.org/10.1080/bih.77.5-6.277.282
Plant Introduction • 89/90 113
Modified staining protocol with Safranin O and Astra Blue for the plant histology
Модифікований протокол фарбування сафраніном О та астра синім для цілей
гістології рослин
Андрій Новіков 1, *, Марія Суп-Новікова 2
1 Державний природознавчий музей НАН України, вул. Театральна, 18, Львів, 79008, Україна;
* novikoffav@gmail.com
2 Український католицький університет, вул. Стрийська, 29А, Львів, 79000, Україна
Різноманітні протоколи фарбування використовуються у ботанічній мікротехніці відповідно
до специфічних гістологічних задач. Зокрема, деякі барвники використовуються суміжно для
отримання контрастного забарвлення тих чи інших хімічних структур (наприклад, лігніну і
целюлози). Один з найбільш популярних протоколів комбінованого фарбування передбачає
використання сафраніну О та астра синього. Сафранін О – це водорозчинний основний барвник,
що забарвлює лігнін у червоний колір. Астра синій – це також водорозчинний барвник, який, однак,
є кислим, і забарвлює целюлозу у синій колір. Зазвичай використовують 1–2 % розчин сафраніну О
у дистильованій воді або ж у 50–70 % етанолі у комбінації з 0.5–1 % розчином астра синього у
дистильованій воді. Ця комбінація барвників дозволяє виявити лігніфіковані структури та отримати
якісне контрастне зображення, що чудово підходить для цілей світлової мікроскопії. Довший час,
астра синій використовувався виключно у водних розчинах, і саме така рекомендація без жодних
додаткових опцій розміщена на сайтах виробників. Однак, у 2002 році для виявлення лігніфікованих
структур у рослин було запропоновано використовувати 1 % розчин астра синього у 95 % етанолі.
Згодом, аналогічні спиртові розчини астра синього були успішно використані рядом дослідників
для різноманітних дослідних задач.
Ми розробили новий модифікований протокол фарбування з використанням 1 % розчинів обидвох
барвників (сафраніну О та астра синього) у дещо нижчій концентрації етанолу (70 %) і випробували
його на квіткових бутонах Gagea lutea (Liliaceae). Новий модифікований протокол підтвердив свою
ефективність. Ми сподіваємося, що новий протокол дозволить спростити процес фарбування
рослинних препаратів завдяки використанню однакових розчинників однакової концентрації та
усуненню різниці в концентрації між послідовними розчинами в серії. Таке комбіноване фарбування
може бути ефективно застосоване для цілей гістології рослин, особливо коли необхідно виокремити
лігніфіковані структури і залозисті тканини.
Ключові слова: астра синій, сафранін О, гістологічні барвники, ботанічна мікротехніка, виявлення лігніну
|
| id | oai:ojs2.plantintroduction.org:article-1587 |
| institution | Plant Introduction |
| keywords_txt_mv | keywords |
| language | English |
| last_indexed | 2025-07-17T12:53:56Z |
| publishDate | 2021 |
| publisher | M.M. Gryshko National Botanical Garden of the NAS of Ukraine |
| record_format | ojs |
| resource_txt_mv | wwwplantintroductionorg/48/664e3f7c8482627b33c79ba4fe899648.pdf |
| spelling | oai:ojs2.plantintroduction.org:article-15872023-08-26T20:39:20Z Modified staining protocol with Safranin O and Astra Blue for the plant histology Модифікований протокол фарбування сафраніном О та астра синім для цілей гістології рослин Novikov, Andriy Sup-Novikova, Mariia Many staining protocols are widely applied in botanical microtechniques and serve specific histological purposes. In particular, some dyes are used simultaneously to receive contrasting colorations of different chemical structures, e.g., lignin and cellulose. One of the most popular differential staining protocols is based on the Safranin O / Astra Blue dyes combination. Safranin O is a water-soluble basic dye that stains lignin in red. Astra Blue is also a water-soluble dye but having an acidic reaction, which stains cellulose in blue. Usually, a 1–2 % solution of Safranin O in distilled water or 50–70 % ethanol is applied in combination with the 0.5–1 % water solution of Astra Blue to detect lignified structures and obtain contrasting pictures convenient for the light microscopy. For a long time, Astra Blue was used exclusively with water solutions, and such recommendation without additional options is indicated on producers’ web sites. However, in 2002 it was proposed to use 1 % Astra Blue solution in 95 % ethanol to identify the lignified tissues. Later, such an ethanol solution of Astra Blue was also successfully applied by other researchers for different experimental purposes.We tested the modified staining protocol with the application of both 1 % Safranin O and Astra Blue solutions in a slightly lower concentration of ethanol (70 %) on the flower buds of Gagea lutea (Liliaceae) and found it working well. We believe that such a modified protocol with the solutions of these two dyes in 70 % ethanol allows simplifying the procedure of the plant material staining due to application of the same concentrations of dissolvent and reducing the difference in solvent concentration between two following contrasting staining solutions. Such differential staining can be effectively applied for plant histology purposes, especially where there is a need to distinguish lignified structures and secretory tissues. Різноманітні протоколи фарбування використовуються у ботанічній мікротехніці відповідно до специфічних гістологічних задач. Зокрема, деякі барвники використовуються суміжно для отримання контрастного забарвлення тих чи інших хімічних структур (наприклад, лігніну і целюлози). Один з найбільш популярних протоколів комбінованого фарбування передбачає використання сафраніну О та астра синього. Сафранін О – це водорозчинний основний барвник, що забарвлює лігнін у червоний колір. Астра синій – це також водорозчинний барвник, який, однак, є кислим, і забарвлює целюлозу у синій колір. Зазвичай використовують 1–2 % розчин сафраніну О у дистильованій воді або ж у 50–70 % етанолі у комбінації з 0.5–1 % розчином астра синього у дистильованій воді. Ця комбінація барвників дозволяє виявити лігніфіковані структури та отримати якісне контрастне зображення, що чудово підходить для цілей світлової мікроскопії. Довший час, астра синій використовувався виключно у водних розчинах, і саме така рекомендація без жодних додаткових опцій розміщена на сайтах виробників. Однак, у 2002 році для виявлення лігніфікованих структур у рослин було запропоновано використовувати 1 % розчин астра синього у 95 % етанолі. Згодом, аналогічні спиртові розчини астра синього були успішно використані рядом дослідників для різноманітних дослідних задач.Ми розробили новий модифікований протокол фарбування з використанням 1 % розчинів обидвох барвників (сафраніну О та астра синього) у дещо нижчій концентрації етанолу (70 %) і випробували його на квіткових бутонах Gagea lutea (Liliaceae). Новий модифікований протокол підтвердив свою ефективність. Ми сподіваємося, що новий протокол дозволить спростити процес фарбування рослинних препаратів завдяки використанню однакових розчинників однакової концентрації та усуненню різниці в концентрації між послідовними розчинами в серії. Таке комбіноване фарбування може бути ефективно застосоване для цілей гістології рослин, особливо коли необхідно виокремити лігніфіковані структури і залозисті тканини. M.M. Gryshko National Botanical Garden of the NAS of Ukraine 2021-06-16 Article Article application/pdf https://www.plantintroduction.org/index.php/pi/article/view/1587 10.46341/PI2021005 Plant Introduction; No 89/90 (2021); 110-113 Інтродукція Рослин; № 89/90 (2021); 110-113 2663-290X 1605-6574 10.46341/PI89-90 en https://www.plantintroduction.org/index.php/pi/article/view/1587/1515 Copyright (c) 2021 Andriy Novikov; Mariia Sup-Novikova http://creativecommons.org/licenses/by/4.0 |
| spellingShingle | Novikov, Andriy Sup-Novikova, Mariia Модифікований протокол фарбування сафраніном О та астра синім для цілей гістології рослин |
| title | Модифікований протокол фарбування сафраніном О та астра синім для цілей гістології рослин |
| title_alt | Modified staining protocol with Safranin O and Astra Blue for the plant histology |
| title_full | Модифікований протокол фарбування сафраніном О та астра синім для цілей гістології рослин |
| title_fullStr | Модифікований протокол фарбування сафраніном О та астра синім для цілей гістології рослин |
| title_full_unstemmed | Модифікований протокол фарбування сафраніном О та астра синім для цілей гістології рослин |
| title_short | Модифікований протокол фарбування сафраніном О та астра синім для цілей гістології рослин |
| title_sort | модифікований протокол фарбування сафраніном о та астра синім для цілей гістології рослин |
| url | https://www.plantintroduction.org/index.php/pi/article/view/1587 |
| work_keys_str_mv | AT novikovandriy modifiedstainingprotocolwithsafraninoandastrabluefortheplanthistology AT supnovikovamariia modifiedstainingprotocolwithsafraninoandastrabluefortheplanthistology AT novikovandriy modifíkovanijprotokolfarbuvannâsafranínomotaastrasinímdlâcílejgístologííroslin AT supnovikovamariia modifíkovanijprotokolfarbuvannâsafranínomotaastrasinímdlâcílejgístologííroslin |